[发明专利]一种检测乙肝病毒YMDD耐药突变的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测乙肝病毒YMDD耐药突变的方法。

背景技术

抗病毒治疗是慢性乙型肝炎治疗的关键，最终的目标是最大程度抑制HBV复制，减少肝硬化、肝细胞癌、肝功能失代偿，延长生存期，提高生活质量。核苷酸类似物能阻断HBV DNA的合成，抑制病毒复制，而拉米夫定是HBV治疗广泛应用的核苷类似物，能显著降低血清中HBV DNA的水平，并可使ALT正常化和肝组织学改善。但长期服用拉米夫定进行抗病毒治疗易出现HBV的YMDD基序发生突变，导致耐药的产生，称为YMDD变异。YMDD变异使患者体内病毒复制出现反弹，病情加重。因此，及早、尽快的检测出YMDD突变对患者实施个体化治疗方案具有重要意义。此外，YMDD的突变不是一蹴而就的，由于乙肝病毒的准种特点，YMDD的发生是一个在抗病毒药物的选择压力的作用下不断累积并最终表现为对核苷类似物的耐药的过程。提高突变型DNA的检测灵敏度，及早发现YMDD耐药的出现，可以尽早更换抗病毒药物，避免耐药的发生。

YMDD变异即HBV逆转录酶的保守序列YMDD中M（蛋氨酸）被V（缬氨酸）或被I（异亮氨酸）所取代，是一种点突变。目前YMDD变异的分子生物学检测方法很多，然而，这些方法在临床实践中费时、技术要求高、对YMDD突变的检测灵敏度不高、检测费用昂贵，无法实现突变DNA的定量。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测乙肝病毒YMDD耐药突变的方法。该方法可定量检测YMDD的耐药突变YVDD，且特异性强、检测灵敏度高，耗时短、成本较低。

为了实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：

本发明的一种检测乙肝病毒YMDD耐药突变的方法，利用RT-ARMS-qPCR方法检测乙肝病毒YMDD耐药突变。

所述RT-ARMS-qPCR方法为：根据乙型肝炎病毒基因序列的YMDD区域设计ARMS引物；分别构建野生型和突变型质粒；以SYBR Green 为荧光检测信号，在ARMS引物的存在下，以构建的质粒为标准品，建立标准曲线，对野生型YMDD和突变型YVDD模板进行定量。

所述引物为：

共同引物KF：5'-TCA TMT TCC TCT KCA TCC TGC-3'

野生型下游引物MR：5'-CCC AAW ACC AVA TMA TCC AT-3'

突变型下游引物VR：5'-CCC AAW ACC AVA TMA TCC GC-3'；

其中M代表A或C；K代表G或T；W代表A或T；V代表G或A或C。

所述RT-ARMS-qPCR的反应体系和反应条件为：采用25μL的反应体系，2倍浓缩的SYBR Premix Ex Taq 12.5μL，引物对20μM各0.4μL，50倍浓缩的ROX Reference Dye 0.5μL，HBV DNA模板2μL，dH₂O 9.2μL；于ABI7000荧光PCR仪进行反应并检测，PCR反应条件：95℃ 30s，然后按95℃ 5s，61℃ 31s，进行40个循环，荧光检测在60℃。