[发明专利]一种RT-PCR检测基因的分析方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及RT-PCR检测基因的处理与分析。

背景技术

本发明是一种关于RT-PCR检测基因的处理分析方法。适用于RT-PCR检测基因相关的生物医学研究或基础生物学研究。

RT-PCR是将RNA的反转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。无论使用何种RNA，关键是确保RNA中无RNA酶和基因组DNA的污染。用于反转录的引物可视实验的具体情况选择随机引物、Oligo dT及基因特异性引物中的一种。对于短的不具有发卡结构的真核细胞mRNA，三种都可。

由一条RNA单链转录为互补DNA(cDNA)称作“逆转录”，由依赖RNA的DNA聚合酶(逆转录酶)来完成。随后，DNA的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖DNA的DNA聚合酶完成，随每个循环倍增，即通常的PCR。原先的RNA模板被RNA酶H降解，留下互补DNA。

RT-PCR的指数扩增是一种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的RNA。RT-PCR广泛应用于遗传病的诊断，并且可以用于定量监测某种RNA的含量。

RT-PCR的关键步骤在是RNA的反转录，要求RNA模版为完整的且不含DNA、蛋白质等杂质。常用的反转录酶有两种，即鸟类成髓细胞性白细胞病毒(avian myeloblastosis virus，AMV)反转录酶和莫罗尼鼠类白血病病毒(moloney murine leukemia vrius，MMLV)反转录酶。

RT-PCR有时候也会指代实时PCR(real-time PCR)。为了与逆转录PCR相区别，通常被写作“定量PCR”(quantitative PCR)或者RTQ-PCR(real-time quantitative PCR)。

本发明找到了一种RT-PCR检测基因的分析的生物信息学方法，可直接针对RT-PCR检测基因进行生物信息学分析，以便于进一步的深入挖掘其生物信息学意义。

发明内容

本发明通过对RT-PCR检测基因进行数据预处理、层次聚类分析、差异基因筛选等生物信息学分析，形成一套用于RT-PCR检测基因的分析方法，其基本流程如下：

步骤一：基因检测及原始数据的获取；

步骤二：层次聚类分析；

步骤三：对原始数据的预处理和均一化；

步骤四：差异表达基因的筛选；

步骤五：差异表达基因的pathway通路分析。

附图说明

图1一种RT-PCR检测基因分析的流程图。

具体实施方式

本发明将以小鼠纯合子、杂合子、野生型样品为实例，介绍本发明的具体实施步骤。

步骤一：基因检测及原始数据的获取。小鼠样品，分纯合子、杂合子，野生型三个组，每组8个样品，用RT-PCR检测三组样品kIT信号相关的32个基因的表达，每个基因3次重复。第一个基因(Actb)是内参。获得原始数据。

步骤二：层次聚类分析。所有的基因表达值换算为2-ΔCt，作为层次聚类算法的输入。其中距离(distance)采用Euclidean distance，连接(linkage)采用average。

步骤三：对原始数据的预处理和均一化。软件使用BioConductor(http://www.bioconductor.org/)。Actb作为对照，计算ΔCt。每个基因3次重复取平均值。最后基因相对表达量(fold change)换算为2-ΔΔCt。

步骤四：差异表达基因的筛选。对于所有基因，利用ANOVA分析，筛选在组间有差异，组内平行性良好的基因。筛选标准P＜0.01。差异表达基因5个。

步骤五：差异表达基因的pathway通路分析。建立信号通路和生物功能网络，将差异基因与相关的信号通路进行比较、整合，找出基

因之间的相互关系。信号通路数据取自KEGG pathway数据库(http://www.genome.jp/keg/pathway.html)。一共涉及7个pathway。

以上是对本发明的描述而非限定，基于本发明思想的其它实施方式，均在本发明的保护范围之中。