[发明专利]一种增殖甲型流感病毒的方法

权利要求书

1.一种增殖甲型流感病毒的方法，其步骤包括：

1)将疑似猪流感感染的气管拭子样品接种含有2μg/mL的TPCK-胰酶的细胞维持液分离病毒并进行判定；

2)对步骤1)判定的血凝阳性样品用H1亚型猪流感的通用引物M684和甲型H1流感的通用引物H1-292进行RT-PCR扩增，进行流感病毒亚型鉴定，其步骤如下：

反转录用的引物Uni12：其核苷酸序列(单链)如下：5’-AGCAAAAGCAGG-3’；

流感病毒cDNA合成：

在20μL反转录体系中进行，依次加入以下组分：

将上述组分混匀后置PCR仪中，42℃60min，95℃5min进行反转录，反应产物直接用于PCR反应；其中：PCR反应的引物序列如下：

M-684和H1-292

M-684U：CAAGACCAATCCTGTCACCTC；

M-684L：AAGACGATCAAGAATCCACAA，扩增得到的片段长度为684bp；

H1-292U：CATTAATGATAAAGG；

H1-292L：TCCAGCATTTCTTTC，扩增得到的片段长度为292bp；

PCR反应体系：

在25μL反应体系中进行，依次加入以下组分：

PCR反应参数：

M684：95℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，30个循环；72℃延伸10min；

H1-292：95℃5min；94℃30s，42.5℃30s，72℃1min，30个循环；72℃延伸10min；

将PCR产物纯化后连接pMD18-T载体，选取阳性病料克隆M684和H1-292测序，判定是否为甲型 H1流感病毒；

3)对甲型H1流感病毒进行全基因组测序，其步骤如下：

以步骤2)所述的cDNA为模板，扩增甲型H1流感病毒8个基因HA，M，NA，NP，NS，PA，PB1和PB2，得到如序列表SEQ ID NO：1-8所示的核苷酸序列，其中扩增上述8个基因的特异引物的核苷酸序列如下所示：

扩增HA基因：

P15’AGCAAAAGCAGGGG 3’，

P25’AGTAGAAACAAGGGTGTTTT 3’；

扩增M基因：

P15’AGCAAAAGCAGGTAG 3’，

P25’AGTAGAAACAAGGTAGTTTTT 3’；

扩增NA基因：

P15’AGCAAAAGCAGGAGT 3’

P25’AGTAGAAACAAGGAGTTTTTT 3’；

扩增NP基因：

P15’AGCAAAAGCAGGGTA 3’，

P25’AGTAGAAACAAGGGTATTTTT 3’；

扩增NS基因：

P15’GCAAAAGCAGGGTG 3’，

P25’AGTAGAAACAAGGGTGTTTT 3’；

扩增PA基因：

P15’AGCAAAAGCAGGTAC 3’，

P25’AGTAGAAACAAGGTACTT 3’；

扩增PB1基因：

P15’AGCAAAAGCAGGCA 3’，

P25’AGTAGAAACAAGGCATTT 3’；

扩增PB2基因：

P15’AGCAAAAGCAGGTC 3’，

P25’AGTAGAAACAAGGTCGTTT 3’；

按步骤2)的方法提取甲型H1流感病毒RNA，合成甲型H1流感病毒cDNA；

甲型H1流感病毒cDNA的PCR扩增：

在PCR反应管中加入反转录产物2.0μL，LA TaqDNA聚合酶(5U/μL)0.5μL，10×LA Taq DNA Buffer5μL，dNTPs Mixture(各2mM)2.0μL，上述8个基因的正向引物和反向引物各2.0μL，用ddH₂O调终体积至50μL，混匀后于PCR仪上进行扩增；

PCR扩增程序：预变性95℃5min，变性94℃30sec，退火52℃30sec，延伸72℃4min，运行35个循 环后于72℃延伸10min。对PCR产物进行回收，连接pMD18-T载体，转化后进行菌液PCR鉴定，将判定为阳性的样品进行测序；

4)将HA效价为8log₂的甲型H1亚型流感病毒以10^-1～10^-3稀释，接种12孔板的MDCK细胞，弃去细胞生长液，换上细胞维持液；

5)将HA效价为8log₂的甲型H1亚型流感病毒以10^-3稀释，接种12孔板的MDCK细胞，在细胞维持液分别加入终浓度为0～4μg/mL的TPCK胰酶；

6)将HA效价为8log₂的甲型H1亚型流感病毒以10^-3稀释，加入TPCK胰酶使终浓度为2μg/mL，接种于12孔板的MDCK细胞，然后分别加入pH为7.0～8.0的细胞维持液，观察细胞病变；

7)将HA效价为8log₂的甲型H1亚型流感病毒以10^-3稀释，加入TPCK胰酶使终浓度为2μg/mL；在pH＝7.6的条件下，用表面积为160cm²的800mL的细胞瓶进行甲型H1亚型病毒增殖；

8)将HA效价为8log₂的甲型H1亚型流感病毒以10^-3稀释，加入TPCK胰酶使终浓度为2μg/mL；在pH＝7.6的条件下，用表面积为2350cm²的10L的转瓶进行甲型H1亚型病毒增殖；

其中步骤1)和4)所述的细胞维持液配方如下：

先取DMEM粉剂一小包，再取HEPES，FREE ACID 4.77g，NaHCO₃7.4g，溶于ddH₂O中，待完全溶解后再用ddH₂O定容至1L，最后用2M的NaOH调溶液的pH至7.4，无菌过滤后储存于4℃条件下备用；

其中步骤4)所述的细胞生长液配方如下：

在细胞维持液中按V/V计加入10％的灭活新生牛血清。

2.适用于权利要求1所述方法的专用菌株，其特征在于，所述的专用菌株是甲型H1亚型流感病毒A-influJML-F9，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏号为CCTCC NO：V201105。