[发明专利]一种结核分枝杆菌异烟肼耐药突变检测方法及试剂盒

权利要求书

1.一种结核分枝杆菌异烟肼耐药突变检测方法，其特征在于包括以下步骤：

1)设计引物和探针：根据GenBank中结核分枝杆菌H37Rv基因组核酸序列，利用引物设计软件Primer Premier 5设计引物和探针；

2)提取结核分枝杆菌样本的DNA；

3)建立PCR反应体系；

4)结果判定：PCR反应结束后，产物通过熔解曲线进行分析，根据熔解峰的熔点和形状的差异，区分野生型和突变型，即完成对结核分枝杆菌异烟肼耐药突变的检测。

2.如权利要求1所述的一种结核分枝杆菌异烟肼耐药突变检测方法，其特征在于在步骤1)中，所述设计引物和探针的具体方法如下：

a，引物设计在所检测的突变两端，探针覆盖突变位点；

b，探针的荧光基团选择通用的探针标记染料，淬灭基团选择通用的探针标记淬灭剂，所述探针标记染料为FAM、ROX、HEX、CY5、CY3、TET、ALEX、CAL Fluor系列染料，所述探针标记淬灭剂为BHQ1、BHQ2或DABCYL。

3.如权利要求1所述的一种结核分枝杆菌异烟肼耐药突变检测方法，其特征在于在步骤1)中，所述引物和探针的序列为：

ahpC-F：5′-CGGCCGGCTAGCACCTCT-3′

ahpC-F：5′-CGGCCGGCTAGCACCTCT-3′

ahpC-R：5′-CCAATGGTTAGCAGTGGCATGACT-3′

inhA94-F：5′-ATCGGGGCGGGCAACAAG-3′

inhA94-R：5′-TAGGGCGCGTCGAAGAACGG-3′

inhA-F：5′-CGGAAATCGCAGCCACGTTAC-3′

inhA-R：5′-ACGGGATACGAATGGGGGTTTG-3′

katG-F：5′-GCGGTCACACTTTCGGTAAGAC-3′

katG-R：5′-CGTACAGGATCTCGAGGAAACTG-3′

ahpC P1：5′-FAM-GTCAGGCATATATCACCTTTGCCTGAC-DABCYL-3′

ahpC P2：5′-FAM-CGCTGCGGCACGATGGAATGTGCAGCG-DABCYL-3′

inhA94-P：5′-TET-GGTGCAACCCAATCGAATGCACC-DABCYL-3′

inhA-P：5′-FAM-CGAGGCCGACAACCTATCGTCTCCCTCG-DABCYL-3′

katG-P：5′-TET-CCGAGGCACCAGCGGCATCGACCTCGG-DABCYL-3′。

4.如权利要求1所述的一种结核分枝杆菌异烟肼耐药突变检测方法，其特征在于在步骤2)中，所述提取结核分枝杆菌样本的DNA的具体方法采用水煮法、酚氯仿抽提法或磁珠提取法。

5.如权利要求1所述的一种结核分枝杆菌异烟肼耐药突变检测方法，其特征在于在步骤3)中，所述建立PCR反应体系的具体方法如下：

采用一对引物扩增一个反应的单重PCR方式，以单个探针与一对引物对搭配，进行PCR反应；或

采用至少二对引物共同扩增的多重PCR方式，以探针混合搭配，进行PCR反应。

6.如权利要求1所述的一种结核分枝杆菌异烟肼耐药突变检测方法，其特征在于在步骤4)中，所述区分野生型和突变型的具体方法如下：比较样品与野生型对照熔点值的差异，若样品与野生型对照在四个检测区的Tm值均一致，则判定为野生型；若样品任一检测区的Tm值低于野生型对照至少2℃。

7.如权利要求1所述的一种结核分枝杆菌异烟肼耐药突变检测方法的试剂盒，其特征在于设有盒体、扩增试剂、对照试剂和提取试剂，扩增试剂、对照试剂和提取试剂放置在盒体内；所述扩增试剂包括INH PCR Mix A、INH PCR Mix B和TB酶混合液；所述对照试剂包括INH阳性对照和TB阴性对照；所述提取试剂为TB DNA提取液。