[发明专利]一种用蛋白类荧光探针对细胞进行标记的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种具有自发荧光的蛋白质分子探针在生物标记方面的应用，这种探针可以在紫外光谱激发下，在细胞体内出现蓝色荧光。 

背景技术

蛋白类荧光蛋白的发展始于1962年科学家下村修在实验中提取美国西海岸近海的水母的体内的水母素时，发现的会发绿色荧光的蛋白质，这是首次发现绿色荧光蛋白(GFP)。随后，于1994年，马丁·沙尔菲将绿色荧光蛋白用在了原核生物(大肠杆菌)和真核生物(线虫)体内，并且发现这些生物体可以发光，由于研究中外源性物质和辅助因子不需要这种荧光，GFP实现了在基因表达和蛋白质定位研究领域的应用，展示了绿色荧光蛋白作为发光的遗传标签的作用，这一技术随后被广泛运用于生理学和医学等领域。钱永健在下村修与马丁·沙尔菲研究的基础上进一步搞清楚了绿色荧光蛋白的发光机理及发光特性。同时，他改造了绿色荧光蛋白，通过改变其氨基酸排序，制造出了能吸收、发出不同颜色光的荧光蛋白，其中包括蓝色、青色和黄色，并且使它们发出的光更持久、更强烈，这些成就将荧光蛋白的在生物学、遗传学领域里的应用进一步加以扩展。 

钱永健利用这些发现开发出各种荧光染料，广泛应用于生物和医学实验。使用这些荧光材料作出的最具代表性实验莫过于2007年的“脑虹”。将红、黄、青3种荧光色素嵌入老鼠基因组，随着老鼠胚胎的生长而分裂生长。研究人员随后用来自细菌的重组基因激活这些色素基因。通过在老鼠不同部位或不同发育阶段使用色素基因，他们成功为老鼠的不同细胞涂上不同颜色。他的课题组还研制出一种神奇的荧光液体，这种液体可以注射到患者体内，使患者体内的神经发光，从而让通常不可见的神经现形。研究发现，用肉眼就可以识别出神经与其他组织之间的颜色差异，而且这种差异比利用其他方式产生的差异要大10倍。实验表明，这种液体的荧光效应通常在两个小时后开始消失，且至多持续8个小时，但对受测目标没有明显的副作用。此外，研究人员还发现，只要有血液流通，这种缩氨酸还可以让受损的神经现形。 

以上是蛋白荧光探针在生物领域里的特异性标记检测研究及应用，由于此类探针属于标记探针，它具有标记探针的所有优势，但同时其无法避免的缺点，如受染料影响细胞易失活、荧光稳定性差等等。正是这些限制了它的长远的研 究与应用。 

在目前生物分析检测领域里，主要有标记检测和无标记检测两个检测大类。 

标记检测主要是与荧光分子结合实现检测。荧光团，酶，放射性同位素标记可以用来作为分子探针。利用时间荧光分辨手段，可以实现染料标记进行生物分析，这些染料具有相似的激发和发射光谱，但具有不同的荧光弛豫时间，这些标记实验主要是接收灵敏检测限，甚至可以做到单分子水平，但标记的附加实验费时，昂贵，在标记位置的洗脱过程里，容易造成样品材料的损伤，更确切的说，蛋白质的化学标记容易改变样品的表面化学特性并影响到其活性。总之，在研究过程中，标记的过程中会影响分子的生物活性，特别是对含有大量抗原表位的小分子蛋白质或者肽类。 

而无标记检测确实可以克服上述问题，分子或粒子的无标记检测是紫外光激发自发荧光团发出荧光实现的，它在生命科学的分子分析中有很大的潜在应用价值，为自然状态下检测重要生物成分提供了一种简单，价廉，快速灵敏的检测方法。标记检测经过科研工作者的不断努力，无标记自发荧光检测在分析化学和生物化学领域里逐渐被人们开始重视。 

分子的自发荧光信号来自于分子内部的结构，如蛋白质，胶原蛋白，弹力蛋白和辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)和黄素类等均可以作为生色团。在蛋白质里，三种芳香族氨基酸残基-色氨酸(Trp)，酪氨酸(Tyr)和苯基丙氨酸(Phe)均是其内部发光团。 

在蛋白质中，氨基酸残基的紫外吸收来源和荧光发射光谱主要取决于其本身的光谱特性。尽管氨基酸吸收系数和量子产率与常用的荧光标记物相比相差很多，而且光学稳定性很差，但蛋白质的资源丰富，可以抵消这些不足，从而使蛋白质的自发荧光的灵敏检测成为可能。