[发明专利]原核来源的泛素样分子的应用

说明书

技术领域：

本发明属于生物工程领域，特别涉及重组蛋白的异源表达。

背景技术：

通过异源基因在宿主细胞，包括细菌、酵母菌、哺乳动物细胞以及昆虫细胞等中进行表达，是目前生产蛋白和/或多肽产品最为常用的方法。使用异源表达系统获得具有生物学活性的均一蛋白，在功能基因组学的研究中也广泛应用。大肠杆菌等原核系统由于菌体细胞简单，表达蛋白成本低廉，得到了更广泛的应用。

然而，不同的异源基因，在同样的宿主细胞，尽管使用相同的表达载体，获得同样的转录和翻译信号，但重组蛋白表达水平可以有很大差别。某些重组蛋白在宿主细胞中不能高效表达有很多原因，包括：宿主细胞的密码子偏好引起异源基因转录和翻译水平低下；重组蛋白由于自身不稳定性，易于被宿主蛋白酶切降解；错误折叠的重组蛋白对宿主细胞酶切降解的易感性提高等等。

为提高重组蛋白的表达水平，可以采取一些策略。例如，在蛋白酶缺失的大肠杆菌菌株中进行表达，以增加重组蛋白的稳定性(Gottesman et al.J Bacteriol 1978.133：844-51)；将宿主蛋白片段与目标重组多肽/蛋白融合，也可以增加外源蛋白在宿主细胞中的稳定性(Itakura et al.，Science，1977.198：1056-63；Shen，Proc Natl Acad Sci USA，1984.81：4627-31)；在原核宿主细胞，将分泌前导序列融合至重组蛋白，可以促使基因产物在细胞周质的累积或外排分泌，提高正确折叠的可溶性蛋白的复性，可能提高蛋白产量(Nilsson et al.，EMBO J，1985.4：1075-80；Abrahmsen et al.，Nucleic Acids Res，1986.14：7487-500)。这些策略对某些蛋白来说有效，但对许多其它蛋白却不一定成功。

因此，存在多种基因融合系统，使用不同的融合伴侣与异源蛋白连接。常见的原核来源的融合伴侣包括谷胱甘肽硫转移酶GST(Smith，Methods Enzymol，2000.326：254-70)，硫氧还原蛋白TRX(Hammarstrom et al.，Protein Science，2002.11：313-321)，以及麦芽糖结合蛋白MBP(Sachdev et al.，Methods Enzymol，2000.326：312-21)等。

真核来源的泛素Ubquitin和小泛素样分子Sumo也是常见的融合伴侣。

泛素是一种在所有真核细胞中广泛存在，序列结构高度保守的低分子量蛋白质，能够与靶蛋白形成共价结合，是蛋白翻译后修饰的一个重要方式。同时，真核细胞中还存在一些与泛素结构类似的蛋白质，称为泛素样蛋白(UBLs)(Dye et al.Annu Rev Biophys Biomol Struct.2007；36：131-50.)。该家族成员具有两个共同的结构特征，β-手握样折叠(β-grasp fold)结构域，和含有双甘氨酸残基的羧基末端柔性结构。他们对靶蛋白的化学修饰方式与泛素相同，既羧基末端的甘氨酸残基与靶蛋白赖氨酸残基侧链氨基形成异肽键连接，但可以产生与泛素化修饰不同的生物效应。已知的UBLs包括SUMO1/2/3，ISG15，FAT10，ATG8/12，NEDD8，UFM1，URM1等。

泛素化一个最主要的作用就是将靶蛋白传递给26S蛋白酶体进行降解(Welchman et al.Nat Rev Mol Cell Biol.2005；6：599-609)。另一方面，靶蛋白被Sumo化后并不会引起蛋白的降解，而是直接或问接改变蛋白在细胞内的定位。尽管他们在真核细胞对靶蛋白的作用不同，但在原核细胞作为融合伴侣表达系统，他们都可以提高目的重组蛋白的稳定性。(Baker et al.J Biol Chem.1994；269：25381-6，Butt et al.Protein Expr Purif.2005；43：1-9.)泛素及Sumo与不表达或低表达蛋白的N-末端进行融合，可以显著提高在真核细胞以及原核细胞内的表达水平。

美国专利7820384也把其它真核来源的泛素样分子包括RUB、HUB、APG8、APG12、URM1和ISG15作为融合伴侣，作为提高宿主细胞中目的蛋白表达水平的方法。