[发明专利]分泌抗β-内酰胺酶单克隆抗体杂交瘤细胞株及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及采用分子生物学、免疫学、细胞生物学等方法获得能够稳定分泌抗β-内酰胺酶抗体的细胞株，特别是一种分泌抗β-内酰胺酶单克隆抗体杂交瘤细胞株及其制备方法。 

背景技术

β-内酰胺类抗生素的抗菌作用强、抗菌谱广、毒性低，是目前临床抗感染治疗最普遍应用的一类抗生素。这类药物的广泛使用(特别是滥用和误用)以及致病菌的突变，致使病原菌产生对该药物严重的耐药性问题。病原菌对β-内酰胺类抗生素产生耐药的最重要的机制是质粒介导或染色体突变使病原菌分泌的一种胞外酶-β-内酰胺酶，该酶可选择性分解牛奶中残留的β-内酰胺类抗生素。微生物活性消失法检测β-内酰胺酶，如待检菌株产生β-内酰胺酶，破坏了青霉素，则在划线两边有枯草芽胞菌生长，否则指示菌仍呈很大抑菌环。β-内酰胺酶破坏β-内酰胺环，碘与被打开β-内酰胺环结合，使蓝色的淀粉-碘复合物转变成无色，提示该菌产生β-内酰胺酶。青霉素被β-内酶胺酶水解后成青霉素酸，pH值下降6.8以下，用酚红指示剂，由红(紫)色(原液：枸橼酸缓冲液pH8.5)→黄色(pH6.8以下)。头孢硝基噻吩(Nitrocefin)的β-内酰胺环被β-内酰胺酶打开，基质由黄色变成红色。免疫学分析法是以抗原与抗体的特异性、可逆性结合反应为基础的分析方法，目前药物残留免疫分析技术主要分三大类：相对独立的分析方法、免疫分析技术与常规理化分析技术联用的方法、免疫受体法。1973年荷兰Van Weeman、Schurrs及瑞典Engvall、Perlmann分别提出酶联免疫吸附法，30多年来国内外学者对免疫学方法检测食品中抗生素进行了大量研究。免疫学分析法快速、灵敏、特异，但前期设备投入、单样检测费用高，如果全部采用免疫法测定乳中的抗生素，按保守估算，每吨牛乳至少要增加100元的检测费用，乳品厂一年增多几十至几百万检测费，企业难以接受，不适合当前我国乳品企业发展。各国对β-内酰胺酶的分析方法按用途、作用和步骤分为筛选法、定量法和确证法三个级别。对原料乳供应者来说，知道是否有β-内酰胺酶即可判断该不该出售或收购，所以适合对大批量乳样进行初筛的微生 物活性消失法和免疫学方法成为近年来的研究热点。 

发明内容

本发明的目的之一在于获得分泌抗体的杂交瘤细胞株，该细胞株特异产生抗β-内酰胺酶的抗体； 

本发明的目的之二在于提供一种上述细胞株的制备方法； 

本发明的目的之三在于提供上述细胞株的应用方法。 

本发明的目的按照下述方案实现： 

分泌抗β-内酰胺酶单克隆抗体杂交瘤细胞株，命名为：杂交瘤细胞Pshw-sp20，该细胞株已提交到中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为：CCTCC№C201124，保藏日期：2011年4月13日； 

所述的分泌抗β-内酰胺酶单克隆抗体杂交瘤细胞株由以下元件构成： 

SHV型β内酰胺酶基因； 

骨髓瘤细胞SP2/0基因； 

细胞株是杂交瘤细胞株，是用SHV型β内酰胺酶免疫小鼠，用脾细胞中B细胞和SP2/0细胞融合得出。 

分泌抗β-内酰胺酶单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备方法，包括以下步骤： 

1)通过药敏分析筛选出产β-内酰胺酶的菌株； 

2)利用分子生物学手段获得高产β-内酰胺酶的保守序列； 

3)将β-内酰胺酶表达在细菌BLR中。 

4)初步纯化表达蛋白作为免疫原，免疫BALB/c小鼠； 

5)在化学物质PEG作用下，SP2/0细胞和免疫的脾细胞融合； 

6)筛选、克隆获得能够分泌抗β-内酰胺酶抗体杂交瘤细胞株。 

本发明利用β-内酰胺酶基因在大肠杆菌中能够表达特性，将β-内酰胺酶在大肠菌中大量表达，表达产物包涵体直接可以作为免疫原，免疫Balb/c小鼠，当免疫抗体效价达到融合要求时，在融合前3d尾静脉加强注射免疫原，取免疫的Balb/c小鼠的脾脏与SP2/0细胞在PEG4000作用下，融合、筛选、克隆获得3株稳定分泌抗β-内酰胺酶单克隆抗体的杂交瘤细胞株。Balb/c小鼠腹腔注射杂交瘤细胞株，收集腹水初步纯化，获3株单克隆抗体，亚类鉴定分属IgG2a和IgM型抗体。 

附图说明

图1：目的基因PCR图；图中：1.DL 2000Marker；2.PCR产物。