[发明专利]一种大孔树脂制备高纯度冠菌酸的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物化工领域，具体涉及一种利用大孔树脂从发酵液中提取冠菌酸的方法，该方法适合从大量发酵液中提取冠菌酸。

背景技术

冠菌酸(coronafacic acid，CFA)是植物生长调节物质冠菌素(coronatine，COR)合成的一个前体聚酮化合物，是茉莉酸(Jasmonic Acid JA)的结构类似物。冠菌酸在很多作物上能够引起与JA和COR类似的效果，研究表明20nmol的COR能够引起中等到重度的番茄叶片黄萎病，而冠菌酸和Me-JA没有引起失绿病斑的产生。在诱导拟南芥、番茄花青素积累和抑制根伸长的实验中表明，COR的效果更显著于Me-JA，而冠菌酸的作用效果介于COR与Me-JA之间。通过研究COR及其前体物质冠菌酸和CMA的作用反应基因来进一步确定各种物质的作用机理，Srinivasa等(2005)利用cDNA芯片技术研究番茄叶片在各种化合物处理后各个时间段的基因表达情况进行了比较，实验结果用Venn图显示COR、冠菌酸与冠烷酸(coronamic acid，CMA)诱导了不同数量基因表达的上调与下降。从这些结果显示出冠菌酸与COR有功能更大程度的重叠作用，但是COR较冠菌酸诱导更多基因的表达。同时研究表明冠菌酸在有些作用方面与COR有类似的效果，有些效果略低于COR的诱导效果，同时也有一些显著低于COR诱导效果的作用。随着研究的深入，特别是JA作用受体的发现，更多研究者开始重新关注冠菌酸的作用，包括冠菌酸的生理作用，以及它的作用形式和机理，目前关于COR的作用研究已经取得了一定的进展，在研究其作用机理时又主要集中在冠菌酸与CMA的作用机理，到底COR的作用是由冠菌酸还是CMA起主导作用，研究的还不是很清楚，近来有研究报道冠菌酸起主导作用，但是冠菌酸具体的作用效果以及机理还缺乏研究，COR对35％的Me-JA诱导的基因有调控作用，而冠菌酸对39.4％的COR调控基因有诱导效应，表明冠菌酸与COR重叠的诱导效果更显著(Srinivasa等2005)。因此人们推测冠菌酸是COR主要起作用的基团，也有研究证明JA与冠菌酸有着相同的诱导效果，研究表明在诱导马铃薯块茎形成，马铃薯块茎细胞伸长以及大豆愈伤组织的生长和诱导燕麦叶片的衰老等作用中，冠菌酸和JA有相同的诱导效果，即相同浓度的冠菌酸与JA诱导效果相似。

综上所述，故大量研究需要进行进一步验证冠菌酸的生理功能以及其作用形式，其中涉及到冠菌酸在作物抵抗逆境胁迫中的大量生理作用，例如冠菌酸是否可以调控植物生长、抑制衰老、促进细胞分化、提高叶绿素含量和植物抗逆性等生理功能，这就需要大量冠菌酸样品的获得。如果冠菌酸可以代替COR来应用于植物逆境胁迫，则冠菌酸有望作为又一种新的植物生长调节物质被广泛应用。因为发酵法获得冠菌酸要比COR的获得更容易，且发酵周期也明显缩短，丁香假单胞菌发酵前期就有冠菌酸的合成，且产量远大于COR，如果冠菌酸能够代替COR应用于作物抗逆调控，不仅能够节约能源，将低成本，同时，工业化生产冠菌酸将更能成为可能，因为冠菌酸的生物合成要比COR的合成更简单，工业化生产的工程菌的获得更为容易。

近年来，集中研究冠菌酸作用机理的研究越来越多，但苦于缺乏冠菌酸样品的获得，不仅发酵合成冠菌酸产量较低，同时冠菌酸的分离纯化工艺也较复杂，很难得到冠菌酸纯品。

大孔吸附树脂是一类不含交换基团且有大孔结构的高分子吸附树脂，具有良好的大孔网状结构和较大的比表面积，可以通过物理吸附从水溶液中有选择地吸附有机物，是20世纪60年代发展起来的新型有机高聚物吸附剂，已在环保、食品、医药等领域得到了广泛的应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种分离纯化冠菌酸的方法，该方法工艺简单，收率高，可达80％以上，纯度90％以上，该方法生产成本低，对冠菌酸的结构和活性没有任何影响，而且耗能低，污染小，完全适应工业化生产的要求。

本发明所提供的提取冠菌酸的方法，包括如下步骤：将含有冠菌酸的微生物发酵液的上清液过以大孔吸附树脂为吸附剂的吸附柱进行吸附层析，洗脱得到冠菌酸；所述大孔吸附树脂为非极性大孔树脂，所述洗脱中采用的洗脱剂为能溶解冠菌酸的有机溶剂。

所述大孔吸附树脂具体可为HPD300、HZ818或YPRII。

所述有机溶剂选自下述7种物质中的至少一种：乙醇、乙醚、石油醚、正己烷、乙酸乙酯、95％(体积百分浓度)乙醇水溶液和丙酮。

其中，所述含有冠菌酸的微生物发酵液的上清液的上柱吸附速度(就是吸附柱底部流出液的速度)为4升/小时-8升/小时。