[发明专利]一组引物及其在家蚕微孢子虫的快速检测方面的应用

权利要求书

1.一组应用于样本微孢子虫快速检测的引物，其特征在于包括引物F2和B2、FI2和BI2，分别具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2 、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。

2.一种权利要求1所述引物的应用，其特征在于应用于制备LAMP法检测家蚕样本微孢子虫用的试剂。

3.根据权利要求2所述引物的应用，其特征在于所述LAMP法检测家蚕样本微孢子虫的方法包括以下步骤：

（1）采用煮沸沉淀法抽提待测样本的模板DNA；

（2）以登录号为D14632的拟假基因rDNA序列为靶基因，采用具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2 、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列的引物，对步骤（1）制备的样本模板DNA进行LAMP反应；

（3）将步骤（2）所述LAMP反应产物中加入1μL 10000×SYBR Green I染色检测。

4.根据权利要求3所述引物的应用，其特征在于步骤（1）抽提样本模板DNA包括以下步骤：

（a）取家蚕样本的中肠于研钵中，液氮研磨后，取200μL研磨液于无菌的1.5 mL离心管中；12000 r/min，离心5 min，弃上清，得孢子沉淀备用；

（b）加100μL DNA裂解液于步骤（a）制得的孢子沉淀中，混匀后，煮沸10～15 min；

所述DNA裂解液：取9 mL 1M Tris-HCl（pH 8.0）、1.8 mL 0.5M EDTA、18 mL 5M KCl和90 mL 1% Triton X-100混匀后，用ddH₂O定容至900 mL；

（c）将步骤（b）煮沸后的混合液在12000 r/min条件下离心，取上清，即为模板DNA溶液，置-20℃冰箱保存备用。

5.根据权利要求4所述引物的应用，其特征在于步骤（b）所述DNA裂解液在与孢子沉淀混合之前先置于110 ℃电热鼓风干燥箱中孵育10～15 min。

6.根据权利要求3所述引物的应用，其特征在于步骤（2）所述LAMP反应采用25 μL反应体系，所述反应体系为：2.5 μL 10×Thermopol Buffer（20 mM Tris-HCl，pH8.8；10 mM KCl；2 mM MgSO4；20 mM（NH4）₂SO₄；0.1% Triton X-100；）；2.8 mM dNTPs；1M甜菜碱；6 μL 25mMMgCl2；40 pmol FI2/BI2、5 pmol F2/B2；2 μL Template DNA；1 μL Bst DNA polymerase（8U）；ddH2O补至25 μL；所述反应条件为：63℃水浴60 min；最后95℃，2 min灭活。