[发明专利]抗人IL-1α单克隆抗体及其应用

说明书

技术领域

本发明属于微生物工程领域，具体涉及一种抗人IL-α单克隆抗体及其制备方法和应用。

背景技术

IL-1（IL-1α和IL-1β）是一种多功能的细胞因子。1972年Gery等人发现在人白细胞的培养上清中含有一种可溶性物质，起初命名为淋巴细胞激活因子或内源性热原质、破骨细胞激活因子、黑素瘤细胞生长抑制因子等，1979年国际统一命名为IL-1。IL-1可由多种细胞合成和分泌，如单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞等。

小鼠和人的IL-1基因定位于2号染色体，含7个外显子。IL-1在不同种属中有较高同源性。在氨基酸水平上，IL-1α和IL-1β在不同种属同源性分别为60%-70%和75%-78%；但在同一种属中IL-1α与IL-1β同源性只有20%-30%。

IL-1α是促炎症细胞因子，能刺激与炎症及免疫相关的基因的表达。IL-1α的前体是由IL-1A基因合成的、无信号肽的31-kDa的分子。IL-1α前体被Ca²⁺依赖的钙蛋白激酶降解为17KD的成熟体和16KD的N氨基末端肽，而活化的细胞产生有活性的膜型的IL-1α。IL-1α无论是胞内的前体还是膜型的IL-1α均有活化作用，因为它的分泌量有限，所以分泌的成熟体的活化作用较陌生。膜型的IL-1α具有免疫激活作用，而胞内的IL-1α前体能调控内环境稳定，如基因的表达、细胞的增殖与分化。

已证实包括白血病，肝癌，黑色素瘤，胃癌等在内的多种肿瘤均表达IL-1α。肿瘤细胞本身以及在细胞因子或细菌产物刺激下能表达IL-1α，而原代细胞需经过炎症或细胞因子的刺激才会诱导表达IL-1α。至今仍不清楚IL-1α异常表达出现在肿瘤发生发展过程中哪一特定时期。而且IL-1α在恶性肿瘤细胞中的表达机制尚不清楚。

为了更方便快捷地检测IL-1α在肿瘤中的异常表达情况及对其功能进行研究，制备IL-1α抗体显得尤为重要。

基于以上分析，需要制备一种高特异性、高效价的鼠抗人IL-1α单克隆抗体，使其能够用于间接免疫酶联吸附实验（ELISA），免疫细胞荧光（Immunocytoflurescence），免疫荧光流式细胞分析（Flowcytometer Analysis）等多种研究手段，以实现IL-1α表达的快速通量检测。

发明内容

本发明目的是提供一种人IL-1α的单克隆抗体，利用该单克隆抗体通过免疫学方法检测人IL-1α基因的蛋白表达水平；本发明的另一目的是提供能产生具有良好识别IL-1α蛋白并能与其进行免疫学反应的单克隆抗体分泌型稳定杂交瘤细胞株，通过该细胞株大量生产均质的、稳定的、多用途的的单克隆抗体。

为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是：一种杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株的保藏信息为：保藏单位：中国典型培养物保藏中心；地址：中国武汉大学；保藏日期：2011年1月7日；保藏编号：CCTCC NO：C201102；分类命名：杂交瘤细胞株L-1F12。

上述杂交瘤细胞株的制备方法包括以下步骤：

利用IL-1α基因（基因序列号是：NM_000575.3）原核表达产物免疫BALB/c小鼠以获取能产生针对该蛋白特异性抗体的致敏B细胞；

获取融合细胞生长克隆：从免疫合格小鼠无菌取其脾细胞作为抗原致敏的B细胞，按常规方法，将B细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合，然后利用常规的融合细胞HAT筛选方法进行筛选，进而获取融合细胞生长克隆；

分泌单克隆抗体融合细胞克隆的筛选：应用双抗体夹心ELISA或间接ELISA检测策略筛选分泌单克隆抗体融合细胞克隆是获取分泌单抗细胞克隆常规手段，发明人选用了间接ELISA检测手段进行检测；使用免疫荧光流式细胞分析加以筛选：即以ELISA检测阳性的作为候选克隆，再采用免疫荧光流式细胞分析阳性作为关键指标以确立其阳性克隆；

单克隆抗体杂交瘤细胞株的获得：采用双筛选方法，仅获得三株合格细胞克隆，其中一株细胞9B12（进行融合细胞培养时共用了12块96孔板，这里指的是第9块板的B行12列孔中的细胞）克隆免疫荧光信号均强于其他二株（4D3和3A7，同样的方法编号），将该克隆细胞按常规单细胞克隆方法进行了二轮亚克隆并对每轮亚克隆进行双筛选：直至所有的亚克隆均呈强双阳性后，从中挑出一株生长最旺的单细胞克隆（编号L-1F12）扩大培养并进行传代冻存。

将上述技术方案中生长最旺的单细胞克隆（编号L-1F12）送交至武汉大学的中国典型培养物保藏中心保藏。

上述技术方案中，采用步骤的策略是基于以下几方面考虑：