[发明专利]一种载有人胰岛素样生长因子-Ⅰ基因的重组转基因载体及其应用

权利要求书

1.一种载有人胰岛素样生长因子-Ⅰ基因的重组转基因载体，所述重组转基因载体包括：外源基因人胰岛素样生长因子-Ⅰ、启动子、增强子元件；其特征在于：构建所述重组转基因载体的转座子为piggyBAC转座子；所述启动子为丝素重链fib-H蛋白启动子，并且该启动子带有下游信号肽相应的DNA序列；所述的增强子为丝素轻链fib-L基因第1内含子的部分序列；重组转基因载体还包括：丝素重链蛋白启动子下游信号肽相应的DNA序列、家蚕丝素轻链fib-LpolyA信号位点的序列。

2. 根据权利要求1所述载有人胰岛素样生长因子-Ⅰ基因的重组转基因载体，其特征在于，所述重组转基因载体还包括：新霉素抗性基因。

3. 权利要求2所述载有人胰岛素样生长因子-Ⅰ基因的重组转基因载体的制备方法，其特征在于：通过基因工程操作将家蚕丝素重链蛋白启动子及其下游信号肽相应的DNA序列控制的人类胰岛素生长因子-Ⅰ基因的表达盒、增强子元件和新霉素抗性基因表达盒克隆进piggyBAC转座子载体构建得到重组转基因载体。

4. 根据权利要求3所述制备载有人胰岛素样生长因子-Ⅰ基因的重组转基因载体的方法，其特征在于：具体包括以下步骤：

(1) 制备IGF-Ⅰ基因；

(2) 将IGF-Ⅰ基因克隆进过渡空质粒，制备载有IGF-Ⅰ基因的过渡载体A；

(3) 制备丝素轻链基因的polyA信号序列，并克隆到过渡载体A中，得到过渡载体B；

(4) 制备丝重链基因启动子及其下游信号肽相应的DNA序列Fib-HS，并克隆进过渡空质粒，制备得到载有Fib-HS基因的过渡载体C；

(5) 以过渡载体B为模板，PCR扩增含有IGF-Ⅰ基因和polyA信号序列的基因片段，然后克隆到过渡载体C中，得到过渡载体D；

(6) PCR扩增得到丝素轻链基因第1内含子中具有增强子功能的的序列，构建带有增强子元件的基于piggyBAC转座子的转基因载体pigA3GFP-en；

(7) 酶切过渡载体D，回收丝素重链蛋白启动子及其下游信号肽相应的DNA序列控制的IGF-Ⅰ基因片段，克隆进同样酶切的pigA3GFP-en获pigA3GFP-en-[FibHS-IGF-polyA]，即得到带有增强子元件和丝素重链蛋白启动子及其下游信号肽相应的DNA序列控制IGF-Ⅰ基因的转基因载体；

(8) 制备家蚕核型多角体病毒IE-1基因启动子，克隆进过渡空质粒，制得含家蚕核型多角体病毒IE-1基因启动子的过渡载体E；制备Neo基因的编码序列及其下游的polyA信号序列，双酶切后克隆进同样双酶切的过渡载体E，制得带有家蚕核型多角体病毒IE-1基因启动子控制新霉素抗性基因neo的重组载体，即过渡载体F；

 (9) 过渡载体F酶切后回收带有IE启动子控制新霉素抗性基因的片段IE-Neo，克隆进同样酶切的pigA3GFP-en-[FibHS-IGF-polyA]质粒，即制得有丝素重链蛋白启动子及其下游信号肽相应的DNA序列控制IGF-Ⅰ基因表达盒、增强子元件、新霉素抗性基因和荧光蛋白报告基因的重组转基因载体，命名为pigA3-FibHS-IGF-en-neo。

5. 应用权利要求2所述载有人胰岛素样生长因子-Ⅰ基因的重组转基因载体制备家蚕丝腺生物反应器的方法，其特征在于：将权利要求1所述载有人胰岛素样生长因子-Ⅰ基因的重组转基因载体与辅助质粒作混合，导入初产卵，孵化，筛选获得带有新霉素抗性基因、荧光蛋白报告基因的家蚕，检测到IGF-Ⅰ基因，育种制成转基因家蚕，得到一种家蚕丝腺生物反应器。

6. 一种可以表达外源基因IGF-Ⅰ的家蚕丝腺生物反应器，所述家蚕丝腺生物反应器以家蚕为载体，其特征在于，反应器是通过权利要求1所述载有人胰岛素样生长因子-Ⅰ基因的重组转基因载体介导获得。

7. 一种生产口服降糖药物的方法，其特征在于，采用权利要求5获得的转基因家蚕的丝腺组织经冷冻干燥后制成药物。

8.一种生产口服降糖药物的方法，其特征在于，收集权利要求5获得的转基因家蚕的蚕茧，粉碎后制成药物。