[发明专利]一种含有loxP-kanr-loxP片段的重组质粒载体p18-kan±的构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种重组质粒载体的构建方法。

背景技术

在进行真核生物基因敲除、替换等实验过程中，往往会用到kan^r基因作为筛选标记，应用loxP位点作为去除抗性标记基因工具位点。在实际应用中，这一功能片段通常是应用融合PCR等互补PCR手段与目的基因重组连接的。但是，在实际操作中往往会因为PCR错配及引物特异性等不足，使得连接失败或产物基因失活，最终导致实验失败。

发明内容

本发明的目的在于提供一种含有loxP-kan^r-loxP片段的重组质粒载体p18-kan^±的构建方法。

含有loxP-kan^r-loxP片段的重组质粒载体p18-kan^±的构建方法按以下步骤进行：一、采用PCR技术从pUG6质粒中获得loxP-kan^r-loxP片段；二、胶回收1.6Kb的loxP-kan^r-loxP片段，然后以2.7Kb的pMD18-T载体作为骨架，通过T-A末端连接，获得连接产物；三、连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，然后涂布于氨苄抗性的LB固体培养基中进行培养，挑取阳性克隆，接种于氨苄抗性的LB液体培养基中震荡培养后采用碱裂解法提取重组质粒，即完成含有loxP-kan^r-loxP片段的重组质粒载体p18-kan^±的构建。

本发明利用pMD18-T载体作为模板，向其多克隆位点上引入loxP-kan^r-loxP基因片段，同时构建出一对连接方向相反的重组质粒，该质粒loxP-kan^r-loxP位点两端具有多个常用酶切位点，外源基因便于与loxP-kan^r-loxP片段连接，为真核生物基因敲除、替换提供了新的操作途径。

本发明PCR获得loxP-kan^r-loxP基因片段，将其连入到质粒载体pMD18-T多克隆位点中，获得重组质粒，经转化、蓝白筛选后获得含有loxP-kan^r-loxP片段的重组质粒载体p18-kan^±，经PCR及酶切鉴定，结果与预期结果相符，测序结果显示loxP-kan^r-loxP片段以两个不同方向成功连入质粒中，含有loxP-kan^r-loxP片段的重组质粒载体p18-kan^±构建成功。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式含有loxP-kan^r-loxP片段的重组质粒载体p18-kan^±的构建方法按以下步骤进行：一、采用PCR技术从pUG6质粒中获得loxP-kan^r-loxP片段；二、胶回收1.6Kb的loxP-kan^r-loxP片段，然后以2.7Kb的pMD18-T载体作为骨架，通过T-A末端连接，获得连接产物；三、连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，然后涂布于氨苄抗性的LB固体培养基中进行培养，挑取阳性克隆，接种于氨苄抗性的LB液体培养基中震荡培养后采用碱裂解法提取重组质粒，即完成含有loxP-kan^r-loxP片段的重组质粒载体p18-kan^±的构建。

本实施方式中pUG6质粒、大肠杆菌DH5α感受态细胞、pMD18-T载体均为购买得到(NewEngland Biolabs Inc.，MA，USA)；本实施方式在具体操作中涉及使用的各种反应试剂或试剂盒均为购买得到(宝生物工程有限公司)，且使用均按说明书操作。

本实施方式步骤二中连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，然后涂布于氨苄抗性的LB固体培养基中进行培养的具体过程：将大肠杆菌DH5α感受态细胞从-70℃取出，在冰上融化后加入5μl连接产物，冰中放置30分钟，然后42℃热休克90秒，再冰浴2-3分钟，加入37℃预热的S.O.C培养基900μl，37℃振荡培养1小时(160-200rpm)，然后4000r/min离心3分钟，弃上清，保留200μl培养基，将沉淀重新混匀后，涂布于氨苄抗性的LB固体培养基中，37℃培养过夜。