[发明专利]肿瘤粘蛋白糖肽抗原决定部位的单克隆抗体库的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程和免疫学领域，具体涉及一种肿瘤粘蛋白糖肽抗原决定部位的单克隆抗体库的制备方法。

背景技术

粘蛋白（ＭＵＣＩＮ）是上皮细胞表达的1型糖蛋白，在细胞表面高表达，并且高度分泌。粘蛋白家族有MUC1, MUC2, MUC3A, MUC3B, MUC4, MUC5AC, MUC5B, MUC6, MUC7, MUC8, MUC12, MUC13, MUC15, MUC16, MUC17, MUC19, 和 MUC20 十九个成员。它们的功能是保护消化道，呼吸道，生殖道的上皮细胞，并调控上皮细胞的细胞通讯和信号传导。

粘蛋白的结构由细胞内区域，跨细胞膜区域，细胞外区域构成。细胞外区域可以被蛋白酶水解而分泌到血液循环中。细胞外区域包括高度糖基化的串联重复多肽片段。每个多肽片段包括10 到 80 个氨基酸。每个多肽含5个以上 Ｏ－糖基化位点。在正常细胞中，这些 Ｏ－糖基化位点被一系列糖基转移酶依次修饰，形成复杂的糖复合物结构。在细胞癌变时，Ｏ－糖基化发生障碍，形成 Ｔn 抗原，即Ｏ－糖基化位点只有一个糖修饰 （图 1）。这个糖是 N-乙酰半乳糖。 N-乙酰半乳糖就是 Ｔn 抗原。它有很弱的抗原性, 但是 Ｔn 抗原和它所连接的多肽却能形成非常强的抗原性。针对癌变细胞异常糖化的抗体已在临床上广泛使用，如 ＣＡ15.3 (1),  和 CA125 (2)。这些抗体是单克隆抗体，通过用癌细胞粘蛋白免疫动物而制备。但是这些单克隆抗体具体的识别位点并不清楚 。这是已有方法的第一个不足之处。

已有抗体的第二个不足之处是一个单克隆抗体只能识别一个带有Ｔn 抗原的糖肽，而粘蛋白的每一个串联重复多肽，可以有数十种带有Ｔn 抗原的糖肽抗原。如图 2 所示，ＭＵＣ1 蛋白的串联重复多肽，可能有31 种糖肽抗原。单一的单克隆抗体，在识别癌变的粘蛋白时，会有零敏度的限制，而且可能遗漏一些重要糖肽抗原。

针对上述缺陷，我们发明了根据免疫糖组学原理的针对肿瘤粘蛋白糖肽抗原决定部位的单克隆抗体库的制备方法。

发明内容

针对上述现有技术的不足，本发明要解决的问题是：1）怎样才能对粘蛋白的复杂的糖肽序列，进行系统学的糖组学研究，2） 怎样才能制备一套完整的抗体库，达到对癌变粘蛋白糖肽的识别。

本发明的技术方案，针对肿瘤粘蛋白糖肽抗原决定部位的单克隆抗体库的制备方法，按照下述步骤进行：

步骤1： 根据粘蛋白的氨基酸序列，推测可能出现的所有肿瘤糖肽序列；

步骤2： 免疫原的制备：用粘蛋白基因转染肿瘤细胞Jurkat，得到用于免疫小鼠制备单克隆抗体的免疫原；

步骤3：用化学合成的方法合成步骤1中推测出的所有糖肽，并分别用生物素标记，得到筛选单克隆抗体的生物素标记的糖肽；

步骤4： 单克隆抗体库的制备，用步骤2的免疫原免疫小鼠，制备杂交瘤，然后用步骤3中生物素标记的糖肽筛选杂交瘤，挑选出针对各个特定糖肽结构的单克隆抗体。

上述方案中的所述的粘蛋白是MUC1, MUC2, MUC3A, MUC3B, MUC4, MUC5AC, MUC5B, MUC6, MUC7, MUC8, MUC12, MUC13, MUC15, MUC16, MUC17, MUC19或（和） MUC20。

当所述的粘蛋白是MUC1时，具体步骤为：

步骤1：根据MUC1的氨基酸序列，推测出可能出现的31个肿瘤糖肽序列；

步骤2： 免疫原的制备：用MUC1基因转染肿瘤细胞Jurkat，得到用于免疫小鼠制备单克隆抗体的免疫原；

步骤3：用化学合成的方法合成步骤1中推测出的31个糖肽，并分别用生物素标记，得到31个筛选单克隆抗体的生物素标记的糖肽；

步骤4： 单克隆抗体库的制备，用步骤2的免疫原免疫小鼠，制备杂交瘤，然后分别用步骤3中的31个生物素标记的糖肽筛选杂交瘤，挑选出针对各个特定糖肽结构的单克隆抗体。

本发明的优点：

1）在免疫原的设计上，本发明建立了表达ＭＵＣＩＮ的肿瘤细胞系，直接用肿瘤细胞表面表达的ＭＵＣＩＮ免疫动物。这一设计优于用 ＭＵＣＩＮ 蛋白或合成ＭＵＣＩＮ糖肽作为免疫原，因为蛋白和多肽在三维构象上会有别于细胞表面的天然构象。

2）在探索癌变粘蛋白的抗原决定部位的历史上，本发明首次提出用免疫糖组学方法，推测了高度糖基化的串联重复多肽片段在癌变时所有可能产生的抗原决定部位。采用化学合成的方法，得到这些糖肽抗原。然后用合成的糖肽作为“鱼饵“来“钓取“单克隆抗体。