[发明专利]一种可溶性B7-H1定量检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种可定量检测可溶性B7-H1的试剂盒，具体涉及利用两株特异性抗人B7-H1单克隆抗体ZH11、10D7以及B7-H1Ig融合蛋白研制用于定量检测分析可溶性B7-H1因子的酶联免疫检测试剂盒的方法，该定量检测体系可应用在肺癌鉴别诊断和预后判断领域。

背景技术

已知有许多受体/配体相互作用都参与诱导、建立和调节抗原特异性免疫反应。为了有效地激活T细胞反应，通常至少需要两个信号。其中除T细胞抗原受体（TCR）识别抗原提呈细胞（APC）上的MHC-抗原复合物以提供第一信号即抗原特异性信号外，还必须获得T细胞与APC表达的共刺激分子相互作用后产生的第二信号。第二信号即为共刺激信号或协同刺激信号。如果仅有抗原特异性信号而缺失共刺激信号，T细胞将表现为无反应或免疫耐受状态，甚至导致凋亡。可见，共刺激信号是T细胞克隆扩增、分化和发挥生物效应所必不可少的。因此，第一信号决定了T细胞活化的特异性，而第二信号则决定T细胞介导的免疫应答能否有效进行。

近年来，分子生物学技术广泛应用于免疫学研究，共刺激分子被不断发现。根据其结构，这些共刺激分子可分为两类：一类是肿瘤坏死因子/肿瘤坏死因子受体超家族，包括CD40/CD154、CD27/CD27L、CD30/CD30L、4-1BB/4-1BBL和Fas/FasL等。另一类是免疫球蛋白超家族，如B7/CD28、LAF1/ICAM-1、ICOS-GL50、PD-1/B7-H1、BTLA/HVEM和CD2/LFA-3等。这些协同刺激分子以受体/配体相互作用的方式传导信号。受体/配体一般表达在不同的免疫细胞表面，通常一个为持续性表达，一个呈诱导性表达的特征。在免疫应答的不同阶段，这些分子以各自独特而又相关联的方式参与信号传导，共同调控机体的免疫反应有效启动、适度应答和适时终止。

PD-1（CD279）是由288个氨基酸组成的免疫球蛋白超家族Ⅰ型跨膜糖蛋白，被认为与细胞凋亡相关而命名为程序性死亡-1（programmed death-1，PD-1）。研究发现，PD-1分子主要在T、B、NK细胞表面呈诱导性上调表达，未成熟的T、B细胞在胸腺和骨髓内发育的特定阶段也有弱表达，PD-1分子C末端的酪氨酸残基可与下游的SHP-1、SHP-2等信号转导分子作用而抑制免疫细胞的进一步活化。B7-H1（B7-H1，CD274）是PD-1的两个配体之一，与B7家族其它成员一样，在蛋白结构上B7-H1分子包含有IgV样区、IgC样区、跨膜区和一个短而保守的胞浆区尾部。B7-H1胞外区有4个保守的半胱氨酸残基，参与Ig样结构中二硫键的形成，保持正确的空间结构。B7-H1的mRNA不仅表达在实质器官组织，如：心脏、肺、肝和胎盘等，部分抗原递呈细胞上也有适度表达，如：活化的B细胞和树突状细胞；在胸腺上皮细胞和多种上皮性来源的肿瘤细胞株上B7-H1 mRNA呈高表达。蛋白水平上，B7-H1在活化的T、B、单核细胞和多种类型的肿瘤细胞（如：肺癌、肝癌、乳腺癌和鳞状细胞癌等）上诱导性表达。大量的研究表明，B7-H1与活化的T细胞上PD-1相互作用可显著抑制效应性T细胞的生物学功能，PD-1或B7-H1的表达改变导致PD-1/PD-L抑制途径发生异常，进而引发机体产生免疫功能亢进/低下性疾病。

Dong H等研究发现，低剂量的激发型抗CD3单抗与B7-H1Ig联合应用可有效刺激T细胞的增殖，促进IL-10的分泌，这种正性刺激作用呈IL-2依赖性，对小鼠B7-H1的研究也获得了类似的结果。但后来更多的研究表明，B7-H1能与其负性受体PD-1相互作用抑制T细胞的增殖和活化，尤其能显著降低IL-2、IFN-γ和IL-10的分泌。B7-H1对T细胞功能的影响主要依赖于TCR和CD28信号的强度，在亚适量TCR信号刺激下，B7-H1对T细胞增殖的抑制作用明显，而在最适量TCR信号时，仅在没有CD28协同刺激信号的条件下才对T细胞增殖发挥促进作用，PD-1/B7-H1抑制途径所介导的效应可被CD28信号或IL-2逆转。因此，PD-1/B7-H1负性信号可显著抑制T细胞的活化增殖和细胞因子的产生。