[发明专利]运用双重PCR引物检测禾草腥黑粉菌和雀麦腥黑粉菌的方法

权利要求书

1.一种运用双重PCR引物检测禾草腥黑粉菌和雀麦腥黑粉菌的方法，既能对菌丝基因组DNA实现双重特异PCR检测，又能对冬孢子实现双重套式PCR检测，其特征在于，所设计的引物和用途如下：

（1）设计腥黑粉菌属通用引物，序列如下：

通用外套引物：IGSUF1：GGA TGC ATT CTG GGG ACG T

IGSUR1：GTA GCC TTG TTG CTA CGA TCT G 

通用内套引物：NIGSUF1：CAC CGC CCA AGC ACG TAC

NIGSUR1：GAC CTT TTG GGG TCA AAC TTC TC

通用外套引物用于腥黑粉菌属菌丝基因组DNA或冬孢子套式扩增，扩增片段约为900bp，通用内套引物用于冬孢子的套式扩增，扩增片段约为700bp，这两套引物用于腥黑粉菌属扩增过程质量监测，检查所抽提的菌丝基因组DNA质量和冬孢子的挑取和破碎，避免检测过程中的假阴性；

（2）设计禾草腥黑粉菌和雀麦腥黑粉菌各自的外套引物和特异引物，序列如下：

禾草腥黑粉菌的外套引物：IGSUF2：GAG CGA TAC CTT TGC ATT CTG ACG T

IGSUR2：CAC TGC ATT CTG GGG ACG TAC

禾草腥黑粉菌的特异引物：PFSF：GAC TCG CGT CAA GCG A

PFSR：GCG AAG GGA AAG TTC GAC，

特异引物的扩增片段约为140bp，这两套引物用于禾草腥黑粉菌的菌丝基因组DNA特异PCR扩增和冬孢子套式PCR的扩增，

雀麦腥黑粉菌外套引物：tubF：GAA GAC GTA TGC GTT GAG GA

tubR：AGG AGG ATG CCG AGC GAG A

雀麦腥黑粉菌特异引物：PNSF：CTC AAC CCT TCC CTC TAT TCC

PNSR：CGA TAC GGA TTC TGC ATT CC

特异引物的扩增片段约为420bp，这两套引物用于雀麦腥黑粉菌的菌丝基因组DNA特异PCR扩增和冬孢子套式PCR的扩增。

2.根据权利要求1所述的一种运用双重PCR引物检测禾草腥黑粉菌和雀麦腥黑粉菌的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

（1）实验材料冬孢子的萌发和菌丝的培养；

（2）菌丝基因组DNA的提取；

（3）冬孢子的挑取与破碎；

（4）菌丝基因组DNA双重PCR检测；

（5）冬孢子双重套式PCR检测。

3.权利要求1和2所述的一种运用双重PCR引物检测禾草腥黑粉菌和雀麦腥黑粉菌的方法以及所设计的6套引物在检测禾草腥黑粉菌和雀麦腥黑粉菌方面的应用。