[发明专利]不含基因组DNA的总RNA制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于酚抽提的、纯化不含基因组DNA的总RNA的方法。

背景技术

随着生命科学发展进入到后基因组时代，RNA表达模式的研究受到越来越多的重视。许多有关RNA的检测方法，如逆转录PCR(RT-PCR)，Northern印迹法，基因芯片以及高通量RNA测序技术也日趋广泛应用。获得高质量、完整且不含其它杂质的总RNA，是应用RNA研究技术的前提。当前，提取RNA有很多种方法，主要归为两类。一类是以酚抽提为基础的方法。这类方法采用变性剂来裂解细胞以及抑制核酸酶，并使用酚抽提来分离核酸。常用的变性剂包括硫氰酸胍(GuSCN)以及十二烷基硫酸钠(SDS)。硫氰酸胍被认为是最强的变性剂之一，可有效裂解细胞以及抑制核酸酶。P.Chomczynski和N.Sacchi提出的酸性硫氰酸胍-酚-氯仿(Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction，P.Chomczynski and N.Sacchi，Anal Biochem 1987，162：156-159)法是目前常用的RNA抽提方法，其采用含有胍盐的裂解试剂裂解细胞，然后采用酚抽提去除蛋白质等杂质，再使用异丙醇或乙醇沉淀即可得到纯化的RNA样品。此法以及由其发展而来的Trizol试剂，对提取RNA酶丰富的材料中的RNA取得了很大的成功。然而对于一些材料如大肠杆菌和脂肪组织，有报道称胍盐裂解的方法不能得到很好的结果。十二烷基硫酸钠是另一种常用的变性剂，其对于某些材料尤其是细菌，可以迅速裂解细胞并同时抑制RNA酶，结合酚抽提可获得较好的RNA样品。另一类方法采用固相吸附。现在很多基于硅胶柱的RNA纯化方法都属于这一类。这类纯化方法利用了在胍盐(硫氰酸胍、盐酸胍等)存在时，核酸可与硅胶膜材料结合的性质，使RNA结合在硅胶膜上；再使用含乙醇的洗涤液去除杂质；最后使用低盐溶液(如TE缓冲液)或蒸馏水洗脱纯化的RNA。但由于小分子量的RNA的在胍盐存在时与硅胶膜结合能力较差，这类方法对小分子量的RNA的回收效率较差。

对于现有的方法还存在一个让研究者困扰的问题，即这些方法本身对于基因组DNA的污染的去除能力较差。由于基因组DNA和RNA的理化性质非常类似，通常的RNA提取方法很难将它们彻底分离。例如，实验测得直接通过SDS-酚法提取得到的大肠杆菌总RNA每微克样品约含10⁷到10⁸拷贝(40纳克到400纳克)的基因组DNA；酸性硫氰酸胍-酚-氯仿法提取得到的大肠杆菌总RNA每微克样品约含10⁵拷贝(400皮克)的基因组DNA。一般的硅胶柱法所得到的RNA每微克约含600皮克到200纳克的基因组DNA(Agilent公司技术文档)。然而，诸如RT-PCR以及基因芯片技术需要完全不含基因组DNA的RNA样品，以避免由于基因组DNA的可扩增性造成对结果的干扰。基因组DNA的去除可以通过DNA酶I(DNase I)的消化完成。然而用于去除RNA中的DNA所需的DNA酶要求非常高，需要完全不含RNA酶的DNA酶(RNase-free DNase)，否则将导致RNA样品的降解，因此价格非常昂贵。DNA酶消化还大大增加了RNA提取的时间。并且在消化过程中，很难实时监测并控制DNA消化的程度。对于不同批次的样品，酶消化程度的不同可能会造成结果的不确定性。因此，如能开发出一种能在纯化步骤中直接去除基因组DNA，而无需DNA酶消化的RNA纯化方法，对于提高RNA的研究的效率将是十分有益的。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种能在纯化步骤中直接去除基因组DNA，而无需DNA酶消化的总RNA制备方法。

本发明解决技术问题的技术方案为：不含基因组DNA的总RNA制备方法，包括以下步骤：

a)使用重悬液重悬需要提取的生物材料；

b)加入与重悬液体积相同的十二烷基硫酸钠溶液，室温裂解3-5分钟，或65度裂解0.5-1分钟；

c)加入酸性醋酸钾溶液，离心，去除出现的沉淀，取上清，醋酸钾和十二烷基硫酸钠溶液摩尔比值为1∶0.9-1.1；