[发明专利]一种纯化包涵体蛋白并复性的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种纯化包涵体蛋白并复性的方法。

背景技术

蛋白质的纯化和复性问题是生物工程中的难点和热点，不仅涉及到分子生物学、细胞生物学等的重大的问题，而且涉及到目前基因工程产品的生产和成本，尤其对大规模生产药用蛋白。一股复性方法存在的缺点是：主要是低浓度下的低复性率，使得整个工艺过程需要大量的缓冲液、大体积的容器、大量的操作时间，这些大大降低了生产的效率，增加了生产成本。聚集体的形成是低活性收率的主要原因。当蛋白在高浓度下折叠复性时，伸展的肽链由于疏水基团的外露，更加的容易由于疏水相互作用或者分子间的错配的二硫键形成聚集体。由于聚集体的形成至少涉及到两个蛋白多肽链，所以是二级或者更高级的反应，蛋白的浓度越高，聚集体的形成就越快、越多，这大大制约了包涵体蛋白的大量生产。

目前国内外工业生产中最经常使用的复性手段有稀释复性法、透析复性法等。稀释法复性蛋白是将包涵体蛋白用复性缓冲液直接进行稀释，而达到其复性的目的，存在着复性时间长、缓冲液用量大、容器体积大、不适合大规模生产；而透析法复性蛋白是将包涵体蛋白放在透析袋中，用不断更换的复性缓冲液逐步将袋中的变形剂透析出来，而达到其复性目的，缺点在于：容易造成蛋白与透析膜之间的吸附，并且由于需要经常更换复性缓冲液，增加了操作步骤和操作时间；这两种方法都存在缓冲液体积大，不仅给后续的村话工艺带来了不便，增加了缓冲液的使用量，提高了生产成本，而且要增大设备的处理量，不适于工业生产。

层析方法是生物技术中最经常使用的分离手段。层析介质及层析环境对蛋白比较温和，处理的蛋白的浓度可以很高，操作简单，完成操作需要的时间短，所以最近也被用来进行复性。利用凝胶过滤层析进行复性是新近发展的复性手段，蛋白在通过凝胶过滤层析介质的同时脱去了变性剂，蛋白发生折叠复性；但是这种过程中变性剂的瞬间脱落，也容易造成聚集体的形成，不溶性的聚集体会造成柱子的堵塞；凝胶过滤层析本身对上样量限制的要求同样限制了这种方法的工业应用。

层析法复性蛋白还包括疏水层析法和离子层析法，都是将蛋白包涵体在层析柱上直接吸附。疏水层析法的步骤为：(1)先将层析柱用高盐缓冲液平衡，(2)蛋白进柱，进行吸附；(3)降低盐浓度，将蛋白洗脱出来；该方法完全除去变性剂，并使蛋白在层析介质上折叠复性，但是这种方法仅适于表明疏水很强的蛋白质，否则疏水层析使用的高浓度的盐离子容易造成蛋白的盐析沉淀。并且一些蛋白在高盐的情况下的活性不高，而离子层析法的步骤为：(1)先将层析柱用低盐或无盐缓冲液平衡，(2)蛋白进柱，进行吸附，(3)提高盐浓度，将蛋白洗脱出来；但该方法一股都用于复性后的蛋白的纯化过程(CN 1064968C，US 4705845，US 4705848，EP 0505846AI，WO 00/03011)，并没有直接使用离子交换层析复性融合蛋白，但是没有洗脱过程的双梯度的设置，难免出现聚集体和错误的二硫键的配对，降低了复性的收率。并且把处在高浓的变性剂条件下的变性蛋白加入到没有变性剂的柱子中时，因为变性剂浓度的瞬时降低，大大增加了聚集体形成的可能。使用不含变性剂的缓冲液复性后的蛋白，不仅仅降低了复性的收率，而且一些目标蛋白吸附在层析介质上没有洗脱出柱，使蛋白的质量回收很低，并且污染了层析柱。有人使用此种过程复性变性的天然溶菌酶蛋白，蛋白的质量收率仅仅在10％左右。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高浓度条件下，高效纯化包涵体蛋白质的方法。

本发明提供了一种纯化包涵体蛋白的方法，该方法为将溶解的包涵体蛋白在离子交换层析柱中进行变性剂浓度的梯度洗脱货pH值的梯度洗脱或同时进行变性剂的浓度梯度洗脱及pH值的梯度洗脱：其具体步骤是：

1)酸性/碱性流动相I或者其它溶液溶解的包涵体蛋白进经流动相I平衡后的离子交换层析柱，包涵体蛋白可逆地被吸附在层析介质上；

2)然后用酸性/碱性流动相II梯度取代酸性/碱性流动相I对包涵体蛋白溶液进行梯度洗脱，洗脱梯度长度为1-5个的柱体积，流动相II中的变性剂的浓度低于流动相I中的变性剂的浓度