[发明专利]免疫七肽的制备方法

权利要求书

1.制备免疫七肽的方法，其依次包括以下步骤：

(1)制备Fmoc-Gly-树脂

称取2-氯-三苯氯甲基树脂N克加注入反应柱中，加入10Nml DCM，室温浸泡30分钟后用真空泵抽干，加入Fmoc-Gly-OH  0.3Ng、DIEA 0.8Nml、和DCM 8Nml，室温反应1.5小时，再加入封闭试剂甲醇Nml室温反应0.5小时，树脂依次用DMF洗涤3次，异丙醇洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc-Gly-树脂；   

(2)制备Fmoc-Ser（tBu）-Gly-树脂

    在步骤(1)的Fmoc-Gly-树脂中，加入8Nml脱帽试剂，室温反应5分钟，抽干，重新加入8Nml该脱帽试剂室温反应20分钟，依次用DMF洗涤3次，异丙醇洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，加入Fmoc-Ser(tBu)-OH 0.64Ng、DIEA0.4Nml、TBTU 0.56Ng、HoBT0.94Ng、和DMF10Nml于室温反应1.5小时，用真空泵抽干，依次用DMF洗涤3次，异丙醇洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc-Ser(tBu)-Gly-树脂；所述脱帽试剂为20%哌啶的DMF溶液v/v；

(3)制备Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-树脂

    在步骤(2)的Fmoc-Ser（tBu）-Gly-树脂中，加入8Nml上述脱帽试剂，室温反应5分钟，抽干，重新加入8Nml该脱帽试剂室温反应20分钟，依次用DMF洗涤3次，异丙醇洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，加入Fmoc- Thr(tBu)-OH 0.5Ng、DIEA 0.4Nml、TBTU 0.56Ng、HoBT0.94Ng、和DMF10Nml反应1.5小时，用真空泵抽干，依次用DMF洗涤3次，异丙醇洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-树脂；

(4)制备Fmoc-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-树脂

在步骤(3)的Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-树脂中，加入8Nml上述脱帽试剂，室温反应5分钟，抽干，重新加入8Nml该脱帽试剂室温反应20分钟，依次用DMF洗涤3次，异丙醇洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，加入Fmoc- Tyr(tBu)-OH 0.8Ng、DIEA0.4Nml、TBTU 0.56Ng、HoBT 0.94Ng、和DMF10Nml反应1.5小时，用真空泵抽干，依次用DMF洗涤3次，异丙醇洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-树脂；

(5)制备Fmoc-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-树脂

    在步骤(4)的Fmoc-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-树脂中，加入8Nml上述脱帽试剂，室温反应5分钟，抽干，重新加入8Nml该脱帽试剂室温反应20分钟，依次用DMF洗涤3次，异丙醇洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，加入Fmoc- Thr(tBu)-OH 0.5Ng、DIEA 0.4Nml、TBTU 0.56Ng、HoBT0.94Ng、和DMF10Nml反应1.5小时，用真空泵抽干，依次用DMF洗涤3次，异丙醇洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-树脂；

(6)制备Fmoc-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-树脂

在步骤(5)的Fmoc-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-树脂中，加入8Nml上述脱帽试剂，室温反应5分钟，抽干，重新加入8Nml该脱帽试剂室温反应20分钟，依次用DMF洗涤3次，异丙醇洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，加入Fmoc-Gln(Trt)-OH 1.4Ng、DIEA 0.4Nml、TBTU 0.56Ng、HoBT 0.94Ng、和DMF10Nml反应1.5小时，用真空泵抽干，依次用DMF洗涤3次，异丙醇洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-树脂；

(7)制备Fmoc-Gly-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-树脂

在步骤(6)的Fmoc-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-树脂中，加入8Nml上述脱帽试剂，室温反应5分钟，抽干，重新加入8Nml该脱帽试剂室温反应20分钟，依次用DMF洗涤3次，异丙醇洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，加入Fmoc-Gly-OH 0.52Ng、DIEA 0.4Nml、TBTU 0.56Ng、HoBT 0.94Ng、和DMF10Nml反应1.5小时，用真空泵抽干，依次用DMF洗涤3次，异丙醇洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc-Gly-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-树脂；

(8)制备Gly-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-树脂

在步骤(7)的Fmoc-Gly -Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-树脂中，加入8Nml上述脱帽试剂，室温反应5分钟，抽干，重新加入8Nml该脱帽试剂室温反应20分钟，依次用DMF洗涤3次，异丙醇洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，甲醇洗涤2次，用甲醇浸泡0.5~3小时，抽干，用氮气吹干树脂颗粒，所得到的树脂为Gly-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-树脂；

(9)免疫七肽粗产品的获得

把吹干的Gly-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-树脂倒入玻璃的切割瓶中，加入预冷至-20~10℃的切肽试剂，冰浴反应1.5小时，过滤除去树脂，加冰乙醚500ml沉淀，3500转3分钟离心收集沉淀物，用乙醚洗涤1~6次，用纯水溶解后，低温冷冻干燥24小时，获得免疫七肽粗品；所述切肽试剂由TFA 9.5Nml、EDT 0.25Nml、和H2O 0.25Nml组成;

Gly  glycine    甘氨酸            

Gln  glutamine  谷氨酰胺      

Thr  threonine  苏氨酸         

Tyr   tyrosine   酪氨酸         

Ser   serine    丝氨酸       

tBu  叔丁基

Trt   三苯甲基

Fmoc     芴甲氧羰酰基

DCM     二氯甲烷

DMF      二甲基甲酰胺

DIEA     N,N-二异丙基乙胺

HBTU    苯并三氮唑·N,N,N`,N`,-四甲基脲六氟磷酸酯

HOAt     N·羟基-7-偶氮苯并三氮唑

TFA       三氟乙酸

EDT       乙二硫醇。