[发明专利]可识别HCV NS5A蛋白的核酸适体、核酸适体的衍生物及其筛选方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于遗传工程技术领域，尤其涉及一种核酸适体、核酸适体的衍生物及其筛选方法和应用。 

背景技术

丙型肝炎病毒(HCV)感染是一种危害严重的全球性健康问题，全世界已有2亿感染者。据估计，每年新增感染者数为300～400万。我国约有4000万至5000万人感染HCV，仅次于乙型肝炎携带者数量。 

目前，治疗丙型病毒肝炎的标准方法是采用干扰素或者干扰素联合利巴韦林治疗。在治疗感染基因型2型和3型HCV的患者中有75％～90％的HCV根除率，然而，仍有约50％的1型和4型HCV感染的病人不敏感。虽然加入利巴韦林能够增强持久的抗病毒应答水平，但也能带来严重的副作用(如溶血性贫血)，这些副作用常常导致20％的患者中断治疗。由于HCV基因组有极大的序列差异性，加之组合疗法的副作用大和治疗价格昂贵，急需开发新方法来有效治疗不同HCV基因型感染的肝病患者。 

核酸适体(Aptamer)是通过指数富集配体系统进化技术(SELEX)从人工合成的DNA/RNA文库中筛选得到的能高亲和性、高特异性结合生物靶标的单链寡核酸分子(ssDNA或ssRNA)。核酸适体的靶标包括多肽、蛋白质、细胞甚至组织等。核酸适体的分子识别功能与抗体类似，识别能力与抗体分子相当甚至更强，但自身又具有许多显著优点，如分子量小、易保存、无免疫原性、容易合成标记、穿透组织能力强、化学稳定性好等，在抗病毒治疗领域具有重要的应用前景。 

作为一种严重危害人类健康的病毒，HCV编码约3100个氨基酸残基组成的多聚蛋白，该蛋白在宿主细胞信号肽酶和病毒蛋白酶作用下，可裂解产生10种HCV蛋白：包括结构蛋白Core、E1和E2、p7蛋白，以及非结构蛋白NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B。其中，非结构蛋白NS5A的功能至今仍不十分明确，近年来的研究表明其定位于内质网膜的细胞质侧，存在基础磷酸化与过磷酸化两种形式(P56和P58)，过磷酸化位点为ser2197，ser2201和/或ser2204，并且含有已知的干扰素敏感性决定区域(IFN sensitivity determining region，ISDR)。越来越多的研究表明NS5A可能是影响和调控HCV复制的关键蛋白，尤其是磷酸化形式对HCV的复制有着重要的影响。Min Gao等(Min Gao，Richard E.Nettles，Makonen Belema，et al.Chemical genetics strategy identifies an HCV NS5A inhibitor with a potent clinical effect.Nature，2010；465：96-100)用化学遗传学方法筛选出了特异性抑制NS5A蛋白的 小分子有机化合物抑制剂BMS-790052，并且该抑制剂能非常有效地抑制HCV的基因组复制。因此，以HCV NS5A蛋白作为特定靶点筛选与其特异结合的核酸适体，然后从这些特异识别靶标的核酸适体中，挑选出特异性结合NS5A蛋白功能结构域的抑制HCV复制的核酸适体，具有非常重要的医学价值，这将为丙型病毒性肝炎及其他肝病药物的开发开辟新的途径。 

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种能有效结合并封闭NS5A蛋白的活性位点、进而抑制HCV复制、并具有显著抗HCV感染能力的核酸适体及其衍生物，并相应提供易于制备、成本低廉的该核酸适体的筛选方法和应用。 

为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为一种可识别HCV NS5A蛋白的核酸适体，其为SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：5中任一序列所示的DNA片段。 

上述技术方案的核酸适体中，五种不同序列的DNA片段依次如下： 

核酸适体序列1(以下简称NS5A-1)： 

5’-ACGTACACTAGTGGTCCGGGCGGGGCTCATTGTCC-3’； 

核酸适体序列2(以下简称NS5A-2)： 

5’-GCGGATTGTCCATTGAACCTTCGTCAACTATGCCG-3’； 

核酸适体序列3(以下简称NS5A-3)： 

5’-CACGCCAGACCAGCCGTCCTCTCTTTATCCGAGCCTTCATCCGAG-3’； 

核酸适体序列4(以下简称NS5A-4)： 

5’-GCTATCTTATGGAAATTTCGTGTAGGGTTTGGTGTGGCGGGGCTA-3’；