[发明专利]假肥大型肌营养不良症致病基因突变检测试剂盒及应用

说明书

所属技术领域

本发明属生物技术领域，具体涉及检测假肥大型肌营养不良症致病基因是否发生突变的试剂盒。 

背景技术

假肥大型肌营养不良症是神经系统最常见的X连锁隐性遗传病，患者表现为骨骼肌进行性无力、萎缩、小腿腓肠肌假性肥大，分为两种类型。假肥大型肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophy，DMD)是较严重的类型，发病率为活产男婴的1/3500.通常于20岁左右因呼吸衰竭和(或)心力衰竭死亡。Becker’s肌营养不良症(Becker’s muscular dystrophy，BMD)是一种症状较DMD轻的类型，发病率为1/20000，一不影响患者寿命。 

假肥大型肌营养不良症(Duehenne muscular dystrophy，DMD)是由定位在Xp21的编码抗肌萎缩蛋白(dystrophin)的dystroplun基因突变所致，约有60％-65％的DMD患者是由于dystrophin基因外显子缺失所致，5％是由于dystrophin基因重复突变所致，其余30％-35％的DMD发病是由于dystrophin基因点突变(碱基置换、颠换、缺失、重复或几个碱基的插入等)所致。 

假肥大型肌营养不良症的发病机制不甚明了，至今尚无有效的治疗方法。所以检出假肥大型肌营养不良症患者的DMD基因突变并查找出相应的女性携带者是减少或预防假肥大型肌营养不良症患儿出生的有效治疗措施。 

发明内容

本发明的目的是提供一种采用DNA测序技术检测假肥大型肌营养不良症致病基因DMD是否突变的试剂盒。 

本检测试剂盒主要包括以下成分： 

(1)DMD基因第1到第79外显子区PCR扩增与测序引物79对，各对引物序列见表1； 

(2)常规PCR扩增试剂，如dNTP、Taq DNA聚合酶等； 

(3)常规PCR产物纯化试剂，如SAP酶、ExoI酶等； 

(4)常规DNA测序试剂，如BigDye mix、EDTA溶液、乙醇溶液、HIDI溶液等。 

表1 DMD基因第1-79外显子区的PCR扩增与测序引物序列 

本试剂盒的使用步骤包括： 

(1)提取样本的基因组DNA； 

(2)DMD基因PCR扩增： 

针对DMD基因第1-79外显子区按照表1设计引物进行PCR扩增。每个反应体系为总体积10μl，包含基因组DNA(100ng/μl)1.0μl、dNTP混合液(2.5mM each)0.8μl、10X PCR反应缓冲液(Mg²⁺free)1.0μl、上游引物和下游引物(10μM)各0.2μl、MgCl₂(25mM)1.0μl、T aq DNA聚合酶(5Units/μl)0.08μl、去离子水5.72μl。反应条件为94℃、12分钟，进行30个循环的94℃、30秒，60℃、30秒，72℃、30秒，然后进行72℃、10分钟。 

(3)PCR产物纯化： 

每个反应体系为总体积12.5μl，包含PCR产物10μl，SAP酶(1units/μ1)0.375μl，ExoI酶(10units/μl)0.1875μl，去离子水1.9375μl。反应条件为37℃、15分钟，72℃、20分钟。 

(4)DNA测序反应 

每个反应的体系为总体积5μl，包含PCR纯化产物1μl，BigDye mix(25％)1μl，DNA测序引物(3.2μM)1μl，去离子水2μl。反应条件为98℃、2分钟，进行25个循环的96℃、30秒，55℃、30秒，60℃、4分钟。 

反应结束后每管加入EDTA溶液(125mM)1μl和乙醇溶液(100％)15μl，于室温下沉淀15分钟；在4℃以3650转/分的转速离心30分钟，轻轻倒去上清液；加入乙醇溶液(70％)30μl，以3650转/分的转速离心15分钟，轻轻倒去上清液；室温放置20分钟后加入HIDI溶液8μl，放入测序仪中。 

本发明所述的试剂盒用于检测假肥大型肌营养不良症致病基因DMD的突变体，可以快速方便地查出致病基因的携带者以及病人，可应用于产前诊断、阻止患儿出生，降低假肥大型肌营养不良症的发病率。 

具体实施方式

实施例1 

一人份检测假肥大型肌营养不良症致病基因DMD是否发生突变的试剂盒，包括以下成分：