[发明专利]南芥菜花叶病毒RT-LAMP检测试剂及制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及检测南芥菜花叶病毒的生物制剂，具体涉及南芥菜花叶病毒RT-LAMP检测试剂及制备方法和应用。

背景技术

南芥菜花叶病毒(Arabis mosaic virus，ArMV)属于豇豆花叶病毒科(Comoviridae)线虫传多面体病毒属(Nepovirus)，病毒粒体为等径多面球体，直径约30nm。ArMV是一种极易传播蔓延的病毒，它的寄主范围广泛，可侵染约174属215种植物，危害蔬菜、花卉、树木等多种经济作物；ArMV引起悬钩子黄矮，草莓花叶，黄瓜矮化斑驳，莴苣褪绿矮化，芹菜矮化坏死，连翘黄果等症状。南芥菜花叶病毒可经种子、汁液、嫁接、机械、菟丝子以及介体线虫传播。目前，该病毒主要分布于欧洲、美洲、大洋洲和亚洲的日本，是我国对外公布的检疫性有害生物。

南芥菜花叶病毒的检测方法主要包括血清学检测(DAS-ELISA)和逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术。血清学方法常用的如公开号为CN101893631的的发明专利申请，是双抗体夹心酶联检测南芥菜花叶病毒的技术，适用于多样本的初筛，具有操作简单的优点，但其检测灵敏度较低，且常常由于抗体制备的质量问题而出现非特异性反应。RT-PCR方法如公开号为CN101307365的发明专利申请，是检测南芥菜花叶病毒的病毒核酸的技术，具有较好的敏感性和特异性，但需要进行DNA电泳等PCR后处理，操作复杂，检测成本较高，检测时间周期较长，需6～8小时，还接触有毒试剂溴化乙锭，易发生交叉污染而造成假阳性结果。

逆转录环介导等温扩增技术(Reverse transcript loop-mediated isothermal amplification，RT-LAMP)的反应试剂包括反应缓冲液(内含引物)、反应酶液和显色剂等，由该反应试剂组成的试剂盒中还包括RNA提取液、阳性对照液和阴性对照液等，该反应试剂依赖于能够识别靶序列上6～8个特异区域的引物和一种具解旋功能且呈瀑布式扩增的Bst DNA聚合酶，在等温条件下可高效、快速和特异的扩增靶序列。由于LAMP呈瀑布式扩增，因此其扩增效率非常高；同时，LAMP识别靶序列上的6～8个特异性位点，其特异性也很强；LAMP只在60℃～65℃进行恒温扩增，只要水浴锅即可，无需特殊的仪器，操作非常简单；而且LAMP的整个检测反应只需1.5h～2.5h，检测周期非常短。

因此，研究建立特异、灵敏以及操作简单的南芥菜花叶病毒RT-LAMP检测的方法，在现场快速检疫及病原诊断等方面具有重要的实际应用价值。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种对南芥菜花叶病毒具有特异性高、检测周期短、成本低廉和操作简单的RT-LAMP检测试剂。

本发明还提供了该检测试剂的制备方法和应用。

本发明系选择南芥菜花叶病毒外壳蛋白(coat protein，CP)编码基因的保守片段为靶目标，应用primer Express 3.0软件，设计合成引物。将设计的多对引物进行反应时间和反应温度优化试验，得到最合适的反应条件。

本发明所述的南芥菜花叶病毒RT-LAMP检测试剂，包括反应缓冲液，所述反应缓冲液包含三对特异性引物，特异性引物序列为：

FIP：5′-ccccgttccattcactaacaactcttttattggtggtatggtcaaggg-3′

BIP：5′-actggaatcaactgtttaaataccccgtttttagggggagcgaatttcaat-3′

F3：5′-taatacactcttgagttactatctagg-3′

B3：5′-taagcgcagtggagttcgat-3′

Loop1：5′-tgccataagtgcaagggct-3′

Loop2：5′-tgttacatcgaggaggatgg-3′

本发明所述的南芥菜花叶病毒RT-LAMP检测试剂的制备方法由下述步骤组成：

一、选择南芥菜花叶病毒CP编码基因的保守片段为靶目标，目标片段长度为226bp，该保守片段的核苷酸序列为：

taatacactc ttgagttact atctaggcat tgggggtatt gtcaagggaa     50

aggtgcatgt ttgtagccct tgcacttatg gcatagtcct aagagttgtt    100