[发明专利]高产杆状病毒的转基因脂肪体细胞系及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种转基因昆虫细胞系，尤其涉及一种高产杆状病毒的转基因脂肪体细胞系及其制备方法和应用，属于转基因动物技术领域。

背景技术

昆虫是世界上种类最多的生物群体，有着丰富的细胞遗传学系统。昆虫细胞系的主要用途表现在：作为研究材料，一直是生理学、发育生物学、细胞生物学、分子生物学和生物化学等科学研究的重要工具；作为杆状病毒表达载体系统的重要组成部分，可表达具有重大经济价值和科学意义的外源蛋白质；作为生物反应器，扩增昆虫杆状病毒，特别是含有外源基因的重组杆状病毒，生产生物杀虫剂。据报道，在1965年第一株昆虫细胞系成功建立后至今，近40年的时间内，已经建立的昆虫细胞系超过500种。它们分别来源于鳞翅目、双翅目、同翅目、膜翅目、直翅目和鞘翅目等170多种昆虫，其中大部分来源于鳞翅目和双翅目昆虫。鳞翅目的细胞系来源于多种组织，包括卵巢、胚胎、血细胞、脂肪体等。昆虫的脂肪体同哺乳动物的肝脏具有相似的功能，是重要的生理代谢组织，也是杆状病毒主要的侵染、复制部位之一，具有重要的应用价值。昆虫细胞系的建立往往需要消耗大量的时间和精力。细胞在体外培养过程中，由于受到各种环境因子的影响，有时会发生自发转化，由原来的二倍体核型转变成多倍体/异倍体核型，细胞的生长特性发生改变而获得永生化。永生化的细胞在生长过程中失去接触抑制，可无限繁殖传代。这样的转化不仅时间长，而且转化率极低。建立一株细胞系往往需要培养大量原代细胞，费时费力，经常守株待兔式地等待细胞自发转化，条件难以控制，常常因污染而前功尽弃。而且体外培养细胞成功传代后，当培养到一定代数时，通常会进入生长抑制状态，生命力明显减弱，增殖能力下降，生长停滞并最终死亡。人工诱导体外培养细胞转化是获得永生化细胞的重要手段。在人工设计的诱变因素下使细胞发生转化，通常只需1-3个月就可实现，而且转化率较高，传代细胞生长周期长、性状稳定。

目前发现，细胞永生化与端粒和端粒酶关系密切。端粒与端粒酶是真核细胞染色体末端的一种特殊结构，由端粒DNA和端粒蛋白质组成。端粒DNA是富含G的高度保守的重复核苷酸序列，参与DNA复制，并对维持染色体的稳定和完全复制有重要作用。人类细胞端粒是由10-15kb的重复序列(TTAGGG)n组成；在植物中端粒以(TTTAGGG)n重复序列出现；昆虫细胞端粒一般是由6-8kb的重复序列(TTAGG)组成。目前已知，在昆虫中存在三种端粒DNA类型：家蚕(Bombyx mori)的端粒DNA由重复序列(TTAGG)n构成(Okazaki et al.1993)；果蝇(Drosophila melanogaster)端粒DNA由转座因子HeT-A和TART组成(Biessmann et al.1990，Levis et al.1993)；摇蚊中的端粒DNA由复杂的基因串联重复序列组成(Nielsen &1993，Zhang et al.1994)。体外培养的细胞每分裂一次，端粒缩短50-200bp，当缩短至一临界值时，细胞就会停止分裂，走向衰老和死亡。端粒酶是一种核糖核蛋白酶，由RNA和蛋白质组成，具有逆转录酶的功能，以自身的RNA为模板合成端粒DNA，以维持端粒的长度。细胞永生化是指体外培养的细胞由于自身的改变或外部条件的影响，逃离细胞的衰老期和危机期，端粒长度始终维持稳定，从而获得无限增殖能力的过程。细胞永生化与端粒酶激活密切相关。端粒的维持依赖于端粒酶的激活。在原代培养的细胞中稳定表达人端粒酶逆转录酶基因(human telomerase catalytic subunit，hTERT)能稳定端粒的长度，使细胞易于永生化(Cemi C.Telomeres，telomerase，and myc.An update[J].Mutat Res.2000，462(1)：31-47.)。虽然有关将端粒酶基因应用于哺乳动物细胞永生化的报道很多，但未见涉及利用转染人端粒酶基因获得昆虫永生化细胞系的报道。通过人工诱导体外转化方法建立来源于昆虫脂肪体并表达人端粒酶逆转录酶基因的细胞系，为获得永生化细胞系提供了重要途径。

发明内容

因此，本发明的目的是针对目前尚无含有人端粒酶昆虫细胞系的不足，提供一种高产杆状病毒的转基因脂肪体细胞系，其含有人端粒酶逆转录酶基因，为获得永生化昆虫细胞系提供了重要途径。

本发明的另一目的是提供一种高产杆状病毒的转基因脂肪体细胞系的制备方法。

本发明的再一目的是提供一种高产杆状病毒的转基因脂肪体细胞系的应用。

针对上述目的，本发明的技术方案如下：