[发明专利]提高案件微量检材脱落细胞DNA提取效率的方法及试剂

说明书

技术领域

本发明涉及案件微量检材脱落细胞DNA高效提取的方法及试剂，属于法医物证DNA检测领域。

背景技术

自从PCR技术应用到生物物证的检验，尤其是应用STR基因座进行分析后，DNA提取便成为法医DNA多态性分析的关键环节，DNA样品质量的好坏将直接关系到后续实验的成败。但在实际检案中，越来越多的案件由于案件本身性质、作案过程及犯罪分子的反侦察意识增强等因素的作用，在一些现场勘查中，很难发现血斑、精斑、毛发、烟头等常规生物检材，因此可能载有人体案件微量检材的检材就成为案件侦破的重要物证。

人体案件微量检材量微，且多为角质化，细胞核多已退化，附着在与人体接触的各种载体上。其载体具有如下特点：①微量表皮细胞等检材大面积分布在载体表面且与载体、污物结合紧密，难以收集转移；②保存时间过长或不当，DNA易降解难以满足16个STR位点多重PCR复合扩增(一个管内16个模板同时扩增)；③此类检材载体多经洗涤，含PCR抑制物。因此，案件微量检材DNA的提取难度大，缺乏稳定的提取方法，容易导致检案失败。

目前，根据案件微量检材的量与其所在载体的差异，DNA提取的方法也不同。衣帽、鞋、袜子等人体接触面较大、可能含有的案件微量检材较多的检材，多通过案件微量检材吸收仪收集检材的案件微量检材后，用自动化工作站或chelex-100法提取，可通过延长孵化时间、增加蛋白酶K的量、减少洗脱体积等方法，以达到提高DNA模板浓度的目的。而当遇到各种工具的木质柄，如斧子的木质柄、各类载体上的指纹，如杯盖上的指印等人体接触部位较少、载体对案件微量检材吸附性较强的检材时，检验人员一般都是根据自己的提取经验采取不同的提取的方法，但往往都是多种试剂盒的交叉使用和多种提取方法的混合应用。如用Chelex-100和蛋白酶K孵育几个小时后经Microcon-100纯化柱纯化浓缩DNA；或用其他试剂盒如QIAGEN M48磁珠试剂盒提取DNA模板，有的还将有机法中氯仿纯化步骤运用其中。这些方法提取的DNA量少、纯度低、长度不完整，不但要用价格昂贵的进口试剂，而且步骤繁琐、耗时较长、操作复杂、个人经验影响较大，成功率比较低。

本发明人优化裂解、结合体系发明提高案件微量检材DNA提取效率的方法及试剂，解决DNA提取过程中遇到的以上问题，并成功应用于实际检案。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，系统优化裂解、结合、清洗体系解决案件检材中只含有微量DNA的提取难题，实现简便、快速，高效地提取微量DNA。

经过不同条件组合、系列对比试验及大量现场案件检材试验，我们发现：①蛋白酶消化、70-100温浴、PEG-乙醇磁珠结合液三点的有机结合能够高效提取微量DNA；②蛋白酶消化、温浴处理能够高效释放脱落细胞DNA，结构完整，在PEG-乙醇体系中易与磁珠结合；③PEG-乙醇结合体系的使用不仅促进磁珠对DNA的高效吸附，而且保证了DNA结构相对完整，获得长度合适DNA片段能够满足案件检测中16个STR位点复合扩增的需要。试剂提取案件微量检材DNA既能够减少成本，简便操作，无需多种试剂盒和多种方法的交叉使用，而且灵敏度高，方法简单，减少了对技术人员经验的依赖，实现了案件检测成功率的提升。

本发明提供了一种提取案件微量检材DNA的试剂，其组成为磁珠悬液；裂解液，其组成为pH＝8.0的Tris-HCl缓冲液；结合液I，其组成为20-50％w/v的PEG，PEG的MW＝8000；结合液II，其组成为乙醇；清洗液，其组成为50-80％v/v的乙醇溶液。

本发明所述的结合液II可用甲醇及丙醇、异丙醇中的一种替换乙醇。

本发明方法可以简便高效地从微量案件检材提取到DNA。

本发明所述的微量案件检材为案件现场遗留的含有微量案件微量检材的生物检材。

本发明所述的转移好案件微量检材的载体为用生物细胞提取仪吸附案件现场遗留的衣物、绳索、电线、木棍等所得到的滤膜。

本发明所述的转移好案件微量检材的载体为用案件微量检材粘取器、透明胶带粘取现场遗留的衣物、绳索、电线、木棍、瓶口、各种把手或手柄、玻璃或桌面等上的指纹等所得到的胶膜或透明胶带。

本发明所述的转移好案件微量检材的载体为滤纸、棉签、纱线等檫拭现场遗留的衣物、绳索、电线、木棍、瓶口、各种把手或手柄、玻璃或桌面等上的指纹等所得到的滤纸、棉签、纱线等。

用于本发明的裂解液、结合液I、结合液II、清洗液没有特别限制，可以为本领域所采用的裂解液、结合液I、结合液II、清洗液。

本发明的主要优点在于：