[发明专利]一种聚乙二醇修饰的猪α-干扰素及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种聚乙二醇修饰的猪α-干扰素及其制备方法，以及含有该聚乙二醇修饰的猪α-干扰素的长效注射剂。

背景技术

猪α-干扰素是一种当机体感染病毒时，由白细胞通过抗病毒应答反应而产生的一种低分子量的糖蛋白，具有抗病毒、抗肿瘤、免疫调节等生物活性。猪α-干扰素用于治疗各种猪病毒性疾病，在临床应用中，其体内循环半衰期短，具有免疫原性和抗原性、易被循环系统清除、需要多次给药等问题，给病猪带来巨大应激，影响治疗效果。同时也增加劳动力成本，使用不便。

聚乙二醇(PEG)是具有良好生物兼容性的中性聚合物，具有高度的亲水性，在水溶液中有较大的水动力学体积，并且没有免疫原性。

目前在关于PEG化干扰素的文献报道中，罗氏公司采用40kD分枝PEG修饰人干扰素，其修饰剂分子量大，蛋白质活性保留过低，仅为7％，药物动力学分析注射后8小时才出现干扰素活性，80小时出现血药浓度高峰，持续时间为10-15天。这样的注射剂并不适合于猪干扰素，因为猪干扰素属于在治疗猪急性病毒感染性疾病时，需要快速发挥作用的活性干扰素，并且药效不能超过7天。因为猪只在生长前期会频繁使用病毒活疫苗(一般间隔10天)，太长时间的体内干扰素活性会干扰病毒活疫苗的效果。

也有方法用干扰素N末段作为单一PEG化位点，这样的结合封闭了干扰素种属特异性位点，降低了干扰素与受体的结合能力，使其活性与赖氨酸修饰的干扰素相比要低很多。现有技术中的修饰率较低，一般为30-40％。

先灵葆雅公司采用12kD线性单甲氧基聚乙二醇琥珀酸亚胺碳酸酯进行修饰，体内活性保持时间过短，在体内5天基本检测不到干扰素活性，不能一周注射一次，并且稳定性不佳，在溶液中不稳定，只能做成粉针剂保存，增加成本，而且给药物使用带来不便。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明的目的之一是提供一种能够有效延长药物半衰期的聚乙二醇修饰的猪α-干扰素。

本发明的再一个目的是提供所述聚乙二醇修饰的猪α-干扰素的制备方法。

本发明的另一个目的是提供含有所述聚乙二醇修饰的猪α-干扰素的长效注射剂。

本发明的聚乙二醇修饰的猪α-干扰素的化学结构式如下：

分子量为20KD-80KD。其中，n和n’的取值在保证总分子量为20KD-80KD的前提下可以是任意的，优选地，n的取值使(OCH₂CH₂)_n的分子量在10KD-40KD之间；n’的取值使(OCH₂CH₂)_n’的分子量在10KD-40KD之间。

本发明所述的聚乙二醇修饰的猪α-干扰素，通过在碱性条件下将聚乙二醇与猪α-干扰素的赖氨酸上的氨基偶联，经阳离子交换层析分离纯化得到。

本发明的聚乙二醇修饰的猪α-干扰素可以通过如下步骤制备：

1)对溶于PBS缓冲液的猪α-干扰素进行透析、浓缩，置换缓冲液，制成含猪α-干扰素的硼酸盐缓冲液；

2)将聚乙二醇修饰剂溶于HCl中，加入到步骤1)所述的含猪α-干扰素的硼酸盐缓冲液中，搅拌下进行修饰反应；

3)加入冰醋酸，将pH值调至4.5-4.8，终止反应，得到反应液；

4)利用阳离子交换层析对步骤3)所得反应液进行分离纯化，得到单聚乙二醇修饰的猪α-干扰素。

其中：

步骤1)的硼酸盐缓冲液中猪α-干扰素的浓度为2-10mg/ml，优选浓度为10mg/ml；硼酸盐缓冲液的pH值为8.4-9.0，优选pH值为9.0；

步骤2)中所述聚乙二醇修饰剂与猪α-干扰素的摩尔比为2-4∶1；HCl的浓度为0.01-0.1M，优选浓度为0.1M；搅拌的转速为500-1000转/分，优选1000转/分，搅拌的时间为2-4小时，优选4小时；

步骤4)的阳离子交换层析采用梯度洗脱，流动相为A相：20mmol/L乙酸-乙酸钠缓冲液，B相：在A相中加入1mol/L氯化钠；B相的浓度梯度为0-50％，洗脱时间为28-35min；流速3ml/min。