[发明专利]高产杆状病毒的转基因卵巢细胞系及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种转基因昆虫细胞系及其制备方法和应用，尤其涉及一种高产杆状病毒的转基因卵巢细胞系及其制备方法和应用，属于转基因动物技术领域。 

背景技术

昆虫细胞系的主要用途表现在：作为研究材料，一直是生理学、发育生物学、细胞生物学、分子生物学和生物化学等科学研究的重要工具；作为杆状病毒表达载体系统的重要组成部分，可表达具有重大经济价值和科学意义的外源蛋白质；作为生物反应器，扩增昆虫杆状病毒，特别是含有外源基因的重组杆状病毒，生产生物杀虫剂。昆虫细胞系具有重要的经济和应用价值，但它的建立往往需要消耗大量的时间和精力。据报道，在1965年第一株昆虫细胞系成功建立后至今，近40年的时间内，已经建立的昆虫细胞系超过500种。它们分别来源于鳞翅目、双翅目、同翅目、膜翅目、直翅目和鞘翅目等170多种昆虫，其中大部分来源于鳞翅目和双翅目昆虫。鳞翅目(Lepidoptera)是昆虫纲第二大的目，全世界已知种达十万种以上，与农业有关的有两个亚目。鳞翅目昆虫具有重大经济意义，除极少数取食显花植物外，许多是农林重要害虫。建立鳞翅目昆虫细胞系为科学研究与生物防治提供了宝贵的生物学材料。鳞翅目的细胞系来源于多种组织，包括卵巢、胚胎、血细胞、脂肪体等。 

到目前为止，来自甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)的细胞系共有6株。Gelernter和Federici(Gelernter，W.D.and B.A.Federici J.Invertebr.Pathol.1986，48：199～207)从剪碎的甜菜夜蛾初孵幼虫组织中，建立了甜菜夜蛾第一个细胞系UCR-SE-1。经克隆形成法，他们又从UCR-SE-1细胞系中分离了SE-UCR-1A细胞系。在SE-UCR-1A细胞系的基础上，Mccarthy和Mckedy(Mccarthy W J，Mckedy D.Dev.Biol.，1990，26(8)：824～828)筛选获得一个缺失了核苷激酶的细胞系。Hara等(Hara，K.，K.Tsuda，M. Funakoshi and T.Kawarabata In Vitro Cell.Dev.Biol.1993，29A(12)：904～907)也从甜菜夜蛾初孵幼虫组织中建立了第二株细胞系Se3FH。Se3FH对SeNPV敏感，生长速度比UCR-SE-1快。经克隆分离的Se301细胞系100％能被SeNPV感染，生长速度比Se3FH快，产生的空斑比Se3FH大。第三株Le-H-HNU7细胞系是通过甜菜夜蛾血细胞建立的，该细胞系对斜纹夜蛾核多角体病毒敏感。第四株SeHe920-1a细胞系也是来源于甜菜夜蛾血细胞，接入微孢子虫(Vairimorpha sp.)的孢子后，比其它来源于鳞翅目昆虫非血细胞的细胞系具有更高的感染细胞能力。其12个克隆株SeHe920Y1至SeHe920Y12中SeHe920Y7感染微孢子虫的能力最强。另外两株是由本实验室建立的来源于甜菜夜蛾幼虫脂肪体的细胞系，这两株细胞系对甜菜夜蛾核型多角体病毒和苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒均非常敏感。 

尽管前述文献已有甜菜夜蛾细胞系的有关报道，然而到目前为止，还没有来源于甜菜夜蛾卵巢的细胞系。昆虫的卵巢通常是成对的，是卵子发生和发育的场所。卵巢是由卵巢管(ovariole)组成，在各类昆虫中卵巢管的数目差异很大，鳞翅目昆虫一般为4、6或8条。自Grace利用卵巢组织建立了第一个昆虫细胞系以来，卵巢一直是细胞系建立的重要组织来源。解剖将要羽化的蛹获得的卵巢组织更易于操作，减少污染机会。更多种类的昆虫细胞系仍存在很大的需求，建立新的来源于昆虫卵巢的细胞系，构建更加高效的杆状病毒表达载体系统是十分有意义的。 

与哺乳动物细胞成熟的培养技术相比，昆虫细胞培养技术亟待建立与完善。昆虫是世界上种类最多的生物群体，有着丰富的细胞遗传学系统。细胞在体外培养过程中，由于受到各种环境因子的影响，有时会发生自发转化，即永生化。永生化的细胞在生长过程中失去接触抑制，可无限繁殖传代，这样的转化不仅所需时间长，而且转化率极低。建立一株细胞系往往需要培养大量原代细胞，费时费力，经常守株待兔式地等待细胞自发转化，条件难以控制，常常因污染而前功尽弃。体外培养细胞成功传代后，当培养到一定代数时，通常会进入生长抑制状态，生命力明显减弱，增殖能力下降，生长停滞并最终死亡。人工诱导体外培养细胞转化是获得细胞永生化的重要手段。在人工设计的诱变因素下使细胞发生转化，通常只需1-3个月就可实现，而且转化率较高，传代细胞生长周期长、性状稳定。