[发明专利]双重荧光定量RT-PCR检测试剂盒及应用

说明书

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及甲型流感病毒和乙型流感病毒核酸双重荧光定量RT-PCR检测试剂盒及其应用。

背景技术

2009年3月18日以来，墨西哥发生了人感染甲型H1N1流感病毒暴发疫情。自墨西哥2009年4月13日出现第1例人感染甲型H1N1流感病毒的死亡病例以来，至5月5日全球已有21个国家经实验室检测确认存在甲型H1N1流感病例，总感染人数上升至1124例，其中死亡人数26例。除墨西哥与美国外，许多国家都报告了甲型H1N1的确认病例。为此，世界卫生组织（WHO）在将全球流感大流行的警告级别提升到4级，4月29日又进一步提高到5级，这意味着在世卫组织六个管辖区域的一个中，至少有两个国家出现了病毒的人际传播，虽然在此阶段大多数国家不会受到影响，但宣布进入第五级是一个强烈的信号，表明大流行迫在眉睫，充分体现了世界卫生组织对这次新型流感流行的重视程度。

在自然界，流感病毒在人以及猪和马等动物，尤其是鸟类中间持续流行。目前，在全球范围内猪群中已造成世界性流行的猪流感病毒血清型仅有H1N1、H1N2、H3N2三种。猪流感是世界上最常见的猪传染病之一，常引起猪的急性呼吸道疾病爆发，其病原猪流感病毒也是甲型流感病毒的成员。猪呼吸道上皮细胞上既有禽流感病毒的受体，唾液酸a-2，3-半乳糖苷（SA a 2，3Gal）又有人流感病毒的受体唾液酸a-2，6-半乳糖苷（SA a 2，6Gal）。因此，猪群在储存流感病毒、诱导流感病毒新亚型出现的环节上起到了重要作用。

有专家对近三十多年来猪流感病毒的重配进行研究，认为从1970年起，在美国的猪群中就已经分离到含有古典猪流感病毒和人流感病毒的重配猪流感病毒，在欧洲和亚洲的猪群中也分离人流感病毒与禽流感病毒的重配毒株，且这些重配病毒在欧洲和亚洲的猪群中持续存在。1984年，在欧洲和亚洲出现的大规模猪流感，很可能也是人源H3N2与禽源H1N1病毒基因片段在猪体内进行重配的结果。此外，自1998年起，猪群中三源重配的H3N2病毒在美国广泛流行，该病毒同时含有人流感病毒的HA、NA和PB1基因，北美禽病毒的PB2和PA基因，以及古典猪病毒的NP、M和NS。

猪流感除了对养猪业的影响之外，最突出的流行病学特点是它具有同时感染人和禽的能力，因此猪流感病毒除具有畜牧业传染病上的意义外，在人类的流感流行中也具有重要的公共卫生意义。流行于猪群中的流感病毒有的具有在人体上复制的能力，这就增加了新流感病毒经猪重配后传播给人类的可能性。因此，许多学者认为，猪体内的流感病毒是人类流感病毒的潜在来源，下一次人类流感大流行的流行株基因中，将会有现今流行于猪群中的流感病毒片段，对猪群中的人、猪、禽流感病毒基因的监测，有可能对人类下一次流感大流行的毒株进行预测。一旦这类重配病毒具有较强的传染性、致病性，并能感染人类，就有可能引起新的世界性流感大流行，这次墨西哥发生的新型甲型（H1N1）流感，也具有这种特点。

在流行后期间，流感的活动可能恢复到通常见到的季节性流感水平。此次甲型H1N1流感病毒流行有可能转而表现为季节性A型流感病毒。在此阶段，重要的是持续监测，这也对检测方法的改进和完善提出了更高的要求。

在4月30日公布针对本次甲型H1N1流感病毒的荧光定量检测方法后，近几天又有许多国家和地区公布了甲型H1N1流感病毒的基因序列。但众所周知，流感病毒是一种变异速率非常快的RNA病毒，自然界中像甲型流感病毒这样变异频繁，变异幅度大的生物是少有的，其变异可以通过抗原漂移与抗原转换这二种机制来实现。在流感病毒的8个基因中，HA变异最快，其次是NA。如甲型流感病毒的HA1基因每年每个核苷酸变异的概率为3～4×10^-3，而细胞染色体DNA的突变率仅为10^-8-10^-10。而HA和NA基因正是甲型H1N1流感病毒检测的重要目标基因。虽然WHO的方法能够检测本次流行的流感病毒，由于流感病毒的高度变异性，同时还应考虑针对我国的猪源流感病毒的监测，因此从方法学的角度去完善流感病毒的检测还需要进行很多探索性工作。

鉴于包括人季节性流感、禽流感和甲型H1N1流感在公共卫生中的重要性与日俱增，所以在流感监测工作中同时要进行多种流感病毒的检测，费时费力而且浪费临床标本与试剂。

发明内容

本发明目的是提供一种双重荧光定量RT-PCR检测试剂盒。该试剂盒主要是针对甲型流感病毒和乙型流感病毒的双重荧光定量RT-PCR检测试剂盒。