[发明专利]一种筛选、识别干细胞的试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种筛选、识别啮齿动物、人类或其他哺乳动物干细胞的试剂盒及其应用。

背景技术

 众所周知，干细胞具有下述特征：1)长期的自我更新能力；2)能够产生高度分化的其它种类细胞；3)本身处于未分化状态；4)一般处于慢周期或静息状态；5)组织中处于相应的小生境(niches)内。

干细胞包括胚胎干细胞(Embryonic stem cells，ESCs)和成体干细胞(Adult Stem Cells，ASCs)，胚胎干细胞是全能性的，在理论上于体内可以再生身体内几乎任意组织，但由于其一方面在获取的伦理、道德等方面遇到了问题，另一方面其在应用上遇到了较为严重的问题，例如移植的胚胎干细胞可控性差，有生长为肿瘤的风险，并且其在移植受体后将会受到受体免疫系统的排斥等等，从而限制了其应用。

鉴于胚胎干细胞研究及应用所遇到的上述问题，科学家期望通过核编程的方式让成体细胞能够回到类胚胎干细胞的状态，经过几十年的研究，终于，在2006年日本科学家山中伸弥(Yamanaka S，Cell，2006.126(4)：663-676，日本专利2008-131577)采用四个诱导因子Oct4、nanog、sox2等导入正常人成纤维细胞内，成功重编程其为类胚胎干细胞，被称为诱导多潜能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)，该细胞具有类似人类胚胎干细胞的特性，它虽然与胚胎干细胞相似，具有能分化成生物体内所有组织的潜力，但是Lowry和Plath发现(Lowry等，CellStemCell，2009.5(1)：111-123)，当进行分子标签比较的时候，胚胎干细胞中某些基因的表达明显与iPS细胞不同，与胚胎干细胞相比，iPS细胞研究仍有问题亟待解决，例如iPSCs具更高基因畸变频率(Loring等，Cell StemCell，2011.8(1)：106-118)、致瘤性风险、编程效率低等等需要克服，因而，尽管研究人员取得了令人印象深刻的进展，要把细胞再编程用于治疗疾病还需要更多一些突破。

成体干细胞是另外一类具有修复、再生、替代能力的未分化细胞类型，通常位于特定的小生境内，在受到外界损伤后，其会动员或者产生新的干细胞，通过增殖、分化的方式形成新的功能细胞，从而调节组织和器官细胞数量保持动态平衡。成体干细胞的多能性特点首先在骨髓中得到的成体干细胞得以发现。造血干细胞是目前研究的最为详尽的成体干细胞之一，在过去近40年里一直是干细胞领域研究的主题，它们在体内进行自我更新的细胞分裂，在单细胞水平分化为所有的造血成份，并在机能上使得重度骨髓抑制的动物和人的骨髓得以恢复。

成体干细胞研究的基础和其在临床上的应用先决条件和最关键条件之一是对干/祖细胞的有效识别、筛选分离。最近越来越多的证据表明成体干细胞可见于多种成熟组织(Moore KA，Science，2006.311(5769)：1880-1885)，并且很可能是由处于静息态(细胞周期外且低代谢状态)和激活(细胞周期内且不能保留DNA标记)态的干细胞共存(Li等，Science，2010.327(5965)：542-545)，但从成体中分离干细胞仍是极具挑战性的任务，一方面在于其数量较少且更难于定位、筛选分离各种组织特异性干细胞，另外一方面在于缺少可靠的特异性分子标记物对其进行识别。

当前，主要有以下现有技术公开了如何得到相关的成体干细胞：

1)采用分子标志物筛选候选的干细胞，例如Thy-1^low或FLK2-Lineage^-Sca-1⁺c-Kit⁺分选造血干细胞群(Christemsen JL等，PNAS，2001.98：14541-14546；Uchida N等，Experimental hematology，1996.24：649-659)，用CD14⁺免疫磁性分离的方法从外周血筛选新的干细胞群(PCT/055950干细胞的提纯、识别及用途)用α₆^bri10G7^dim(LiA等，PNAS，1998.95(7)：3902-3907；Tani H等，PNAS，2000.97(20)：10960-10965；Lavker RM等，PNAS，2000.97(25)：13473-13475)识别人类、啮齿动物来源的上皮干细胞，但其有效性还有待进一步证实；