[发明专利]抑制猪生长抑素受体2基因表达的siRNA

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学以及生物工程技术领域，具体涉及抑制猪生长抑素受体2基因表达的siRNA片段。

背景技术

shRNA即短发夹RNA（short hairpin RNA）。在RNAi干扰过程中，产生dsRNA的一个有效方法就是在体内表达一个短发夹RNA，这种shRNA包含两个短反向重复序列（其中一个与目的基因互补），中间由一个loop序列分隔，组成发夹结构。在体内shRNA可以加工成siRNA(small interfering RNAs，siRNA)，从而降解目的基因抑制其表达。

RNAi(RNA interference，RNAi)是由双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)分子在mRNA水平关闭相应序列基因表达或使其沉默的过程。因此，RNA技术又被形象地称为基因沉默 (gene silencing)。RNA是一种典型的转录后基因调控方法，又称转录后基因沉默（post-transeriptional gene sileneing PTGS)。

siRNA是RNAi机制中最重要的发现。生物学研究证实，siRNA为3′端突出2-3nt，长为19-23 nt的双链RNA，5′端为磷酸基，3′端为羟基，这种结构特点说明dsRNA被与RNaseIII相似的酶加工过。RNA干扰包括起始阶段和效应阶段 (initiation and effecting steps)。在起始阶段，加入的双链RNA被切割为21-23个核苷酸的小分子干扰RNA (small interfering RNAs，siRNA)。研究表明:Dicer酶是RNaseIII家族中能特异识别双链RNA的一种，它以一种ATP依赖的方式逐步切割由外源导入或者由转基因、病毒感染等各种方式引入的dsRNA，将dsRNA降解为21bp左右的双链RNA，每个片段的3′端都有2个碱基突出。在RNAi效应阶段，siRNA双链结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA诱导沉默复合物(RNA-induced  silencing complex，RISC)。 激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA转录体上，mRNA与siRNA的反义链结合，置换出正义链，然后RISC上的核酸酶以一定的间隔，在被识别的2个核酸中间进行切割，以核酸内切酶作用方式对mRNA进行核酸内切割，导致mRNA降解。

在体外(in vitro)可用不同的方法将siRNA导入靶细胞，一般来讲化学合成和体外酶法合成的siRNA可用电转移、微注射和转染的方法引入细胞。而表达质粒则常通过转染的方法导入靶细胞然后再表达siRNA。向体内(in vivo)导入siRNA的方法，有研究者用静脉注射的方法将合成的siRNA引入动物体内进行基因功能的研究(Elbashir et al., 2001)，但这些方法所产生的抑制效应都很短暂。如果以病毒为载体则能进一步提高转染效率。以逆转录病毒载体的shRNA在抑制HIV及丙肝病毒等方面的研究，显示了较好的效果。慢病毒载体是常用的病毒载体之一，其特点为免疫原性低，能感染分裂相和非分裂相细胞，能将自身携带片断整合入宿主细胞基因组。目前研究表明慢病毒载体能在哺乳动物各类细胞稳定表达siRNA，长期抑制基因表达。