[发明专利]草鱼B细胞易位基因-1序列

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学中的基因克隆领域，尤其涉及草鱼B细胞易位基因的核苷酸及氨基酸序列。 

背景技术

BTG/TOB基因家族是一系列具有抑制细胞增殖作用的基因。其参与细胞分化、发育、凋亡、肿瘤细胞抑制等各种生理及病理过程并发挥着重要的作用。B细胞易位基因-1(BTG-1基因)是BTG/TOB基因家族的成员之一，在静止期和分化的细胞中表达，其作用主要为调节细胞增殖和分化。目前对其基因的研究不多，且主要的研究集中在人上，对鱼类的BTG-1基因研究就更少，目前只克隆到斑马鱼(Danio rerio)、白斑狗鱼(Esox lucius)和大西洋鲑(Salmo salar)三种鱼类的BTG-1的cDNA全长。 

目前B细胞易位基因-1在草鱼基因研究上还属空白。本基因的获得可以进一步研究该基因在草鱼细胞中的组成及基因结构，并为研究该基因在草鱼生长中的作用提供更高层次的科学服务，为研究草鱼功能饲料提供理论依据和新思路。 

发明内容

本发明的目的是以本实验室保存草鱼肠道cDNA文库中B细胞易位基因-1EST序列为模版设计引物，结合RACE技术，用PCR法扩增克隆得到草鱼B细胞易位基因-1的全表达序列。 

上述目地是通过以下技术方案来实现的： 

取出新鲜草鱼肠道组织，采用TRIzol(Invitrogen Corporation)一步法提取总RNA，甲醛变性凝胶电泳和DNA/RNA calculator(Qenequant)检测总RNA质量。 

本实验室保存草鱼肠道cDNA文库中筛选到B细胞易位基因-1(BTG-1)EST序列，经测序比对后发现该EST序列具有B细胞易位基因-1cDNA的完整3’端，欠缺cDNA序列的5’端。利用cDNA末端快速扩增技术(Rapid Amplification of cDNA ends，RACE)对目的基因的5端进行扩增。 

根据Takara 5′-Full RACE Kit试剂盒，通过本实验室草鱼肠道cDNA文库中B细胞易位基因-1EST序列设计外侧(GSP1)和内侧(GSP2)两个特异引物： 

GSP1：5’-GTGGGATTCGTAGAGCACGCAGAT-3’ 

GSP2：5’-ATCATGTAGGGTTTAGCGGGACTG-3’ 

分别对应试剂盒中： 

5′RACE Outer Primer：5’-CATGGCTACATGCTGACAGCCTA-3’ 

5′RACE Inner Primer：5’-CGCGGATCCACAGCCTACTGATGATCAGTCGATG-3’ 

以TRIzol一步法提取总的RNA为模板，进行Outer PCR反应和Inner PCR反应。 

反应结束后，取5～10l PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳，确认PCR扩增产物。得到大小为650bp左右的清晰条带。 

PCR结果琼脂糖凝胶电泳胶回收后连接到pMD19-T质粒，转入E.Coli DH5α菌株，经质粒酶切验证后用M13通用引物测序。扩增得到片段大小为623bp。 

将测序结果和已知EST序列拼接所得序列进行比对，对全序列进行调整后获得了完整的草鱼B细胞易位基因-1序列，既目的基因。 

通过该基因的原核表达和蛋白免疫印迹(Western blotting)，证实该基因的表达蛋白为BTG-1蛋白。进一步证实该基因确为BTG-1基因。 

草鱼肠道细胞B细胞易位基因-1序列的获得可以进一步研究该基因在草鱼细胞中的组成及基因结构，并为研究该基因在草鱼生长中的作用提供更高层次的科学服务，为研究草鱼功能饲料提供理论依据和新思路。 

附图说明

图1是BTG-1原核表达的蛋白和BTG-1蛋白抗体结合的免疫印迹示图。 

具体实施方式

下面通过以下具体实施方式对本发明作进一步阐述，但本发明的内容完全不局限于此。 

1.总RNA的提取 

挑选实验材料——健康雌性草鱼，体长340mm，约1.1冬龄(13个月)，1.3kg。取出新鲜草鱼肠道组织，液氮迅速冷冻后保存于-80℃冰箱备用。采用TRIzol(Invitrogen Corporation)一步法提取总RNA，甲醛变性凝胶电泳和DNA/RNA calculator(Qenequant)检测总RNA质量。 

2.引物设计依据和合成方法