[发明专利]一种测定ATP的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种ATP含量的测定方法，特别涉及一种利用Profile-1生物发光仪测定含菌水体、土壤、污泥中ATP含量的测定方法，以及通过测定ATP的含量间接表示出土壤中微生物量的方法。

背景技术

ATP(Adenosine Triphosphate)是生物体内一种特定的高能磷酸化合物。正常生物体细胞内的ATP含量是相对稳定的。故ATP含量与活性微生物量之比可以认为是常数。因此，ATP可以作为一种指标表征活性微生物量。ATP生物发光法是利用ATP与虫荧光素-虫荧光素酶反应，产生光子，再用荧光检测器检测发光值，从而得到ATP的量。其反应过程如下：

目前文献报道的微生物ATP提取方法主要有3种，即热提取法、酸提取法及有机溶剂提取法。酸提取，主要使用TCA(三氯醋酸)，TCA对细菌ATP有较高的提取效率，但是提取液中有若有大量TCA存在，会使荧光素酶因酸度过低而失活；为了降低这种作用，需对提取液进行适当的稀释，但是这样就降低了ATP测定的灵敏度。有机溶剂提取对脂肪和蛋白质含量高的生物材料较为有利，但在提取液中不能残留有机溶剂。因为有机溶剂是荧光素酶的抑制剂。热提取是采用煮沸的方法提取ATP，这种方法对荧光素酶无抑制作用，但是操作复杂。在土壤中，由于大部分微生物都吸附在土壤颗粒上，在预处理过程中，不易对其进行富集也不易使之转移到水溶液中，致使最终收集到的ATP浓度低于土壤中的实际浓度，这限制了ATP生物发光法在土壤学中的应用。

Profile-1生物发光仪，由于体积较小，便于携带，主要被用于对现场食品成品、饮料、仪器等各种对象进行细菌总数的检测。其检测灵敏度高，量程可达0～10⁷cfu·mL^-1或cfu·g^-1，高于一般ATP荧光检测仪灵敏度1～2个数量级。然而在大量的土壤样品分析过程中，我们发现与Profile-1生物发光仪匹配的ATP提取方法对土壤样品微生物中ATP的提取率较低，因此其用于检测土壤中微生物量的灵敏度和准确性较低。这可能是因为土壤样品成份较复杂，仪器自带的ATP提取法不能有效提取土壤微生物中的所有ATP。

苯扎溴铵(BAB)，主要成分为溴化二甲基苄基烃铵，可贮存较长时间而效果不减，性状稳定。它为季铵盐类阳离子表面活性剂，它能改变细菌细胞膜通透性，使菌体胞浆物质外渗，阻碍其代谢而起到杀灭作用，是一种广谱杀菌剂，广泛用于环境消毒。

然而现阶段，由于ATP提取方法和ATP检测仪灵敏度和检出线的限制，ATP生物发光法多用于全血、水环境和食品中活性微生物量的检测。对于像土壤这样固体样品的ATP检测，目前却没有一个快速、高效的方法，所以找到一种适用范围更加广泛的高灵敏度和可靠性的ATP检测方法是非常有价值和必要的事情。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种灵敏度和准确性方面都有显著的提高的测定ATP的方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

一种测定ATP的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)制取样品的待测溶液；

(2)在待测溶液中加入苯扎溴铵溶液得到混合溶液；

(3)用定量滤纸对步骤(2)得到的混合溶液进行吸取过滤，将得到的滤液放入已加入荧光素酶的过滤比色杯中；

(4)使用型号为Profile-1的生物发光仪进行ATP测定。

步骤(1)中所述的样品的待测溶液为土样分散液，制取过程包括以下步骤：将土样放入灭菌水中，控制土样的浓度为0.5～2g/ml，然后向其中加入10～15粒玻璃珠，放入摇床振荡60min，控制转速为160rpm，搅拌得到待测溶液。

步骤(2)具体包括以下步骤：吸取步骤(1)振荡得到的待测溶液，加入到苯扎溴铵溶液中，控制待测溶液与苯扎溴铵溶液的体积比为1∶4，振荡均匀即可。

所述的苯扎溴铵溶液的浓度为0.05wt％。

步骤(3)中所述的荧光素酶与滤液的体积比为1∶1。

与现有技术相比，本发明使用BAB改良分析法的ATP提取率高于Profile-1生物发光仪自带的标准分析方法对于ATP的提取率，特别是对于土壤ATP检测，本发明的方法在灵敏度和准确性方面都有显著的提高，因此BAB改良分析法配合Profile-1生物发光仪可以应用于各类固体样品的ATP含量及其微生物量的检测，具有良好的应用前景和实用价值。

具体实施方式