[发明专利]一种猪链球菌7型高密度发酵培养基及专用菌株

说明书

技术领域

本发明属于农业微生物技术领域，具体涉及一种适合猪链球菌7型的高密度发酵培养基及应用，本发明还包括适用于上述培养基的专用菌株的筛选。

背景技术

猪链球菌感染已经成为全世界养猪业的主要问题之一。其可引起猪的脑膜炎，关节炎，心内膜炎，肺炎及败血症等，也可引起人的死亡。目前，根据其荚膜抗原的不同，已发现33种血清型，其中能引起人和动物发病的致病性猪链球菌血清型主要是1型(SS1)、2型(SS2)、7型(SS7)和9型(SS9)[Wisselink等，2002]。猪链球菌2型是流行最广的血清型，除2型菌株之外，7型菌株也是被经常分离到的血清型之一[赵战勤，2007；江甜等，2009；杨筱微等，2010]。

随着7型菌株在我国病猪中的频繁发现，对其各方面特征的研究也就显得非常必要。研究发现国内分离的猪链接菌7型菌株，其毒力因子分布与国外同种血清型的分离株均不同，与国内流行的2型菌毒力因子分布差异显著，且对小鼠有致病性[赵冉，2006]。在国内的一些地方，猪链球菌7型比其他菌株更流行[沈萍等，2009]。而长期地滥用抗生素又导致了国内分离株的多重耐药性，因此针对猪链接菌7型菌的疫苗开发显得尤为紧迫与必要。

对于猪链球菌7型的培养目前还没有固定的培养基，国内外较多应用商品化TSB培养基培养。这种培养基虽然使用方便，但在培养过程中，具有菌体生长缓慢，成本高等缺点，其培养基的成分不适合猪链球菌7型的培养，且发酵终点的活菌数仅为10～20亿，不适合大规模增菌使用。因此，完全有必要研制并开发适合工业规模化生产，且原料来源广泛，价格低廉，能大幅度提高活菌数的培养基。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提出一种猪链球菌7型的高密度发酵培养方法，专用培养基及专用菌株。本发明既能保证猪链球菌7型菌的旺盛生产，进行正常代谢，又能提高其生长速度，缩短生产时间。本发明还提供了适用于上述培养方法的专用培养基及专用菌株(猪链球菌7-YZ)以解决目前猪链球菌7型活菌数不高的难题。

本发明的技术方案如下所述：

申请人从湖南省永州市某猪场送检的病料中分离得到一株具有致病性的猪链球菌7型菌株，申请人将其命名为猪链球菌(Streptococcus suis)7-YZ，该菌株于2011年5月5日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏编号为CCTCCNO：M2011160。

一、猪链球菌7-YZ的分离、筛选和鉴定

1、猪链球菌7-YZ的分离：

待分离的病料——各组织病料是申请人于2005年8月从湖南省永州市某猪场送检的病料中分离得到。其具体分离方法为：无菌采集心血、肺组织、脾组织、关节液接种于TSA平皿上，37℃培养12-24小时后观察。挑取直径为0.1mm-1.0mm、灰白色、半透明、表面光滑、圆形、边缘整齐的小菌落接种于TSB液体培养基中37℃摇床培养过夜。将纯培养后的细菌进行革兰氏染色镜检。然后用光学显微镜观察，革兰氏染色呈阳性、成双或短链状球菌(图1)，对其传代纯化。初步判定其为一株猪链球菌。

2、猪链球菌7型的分类鉴定：

采用PCR方法、生化鉴定及玻片凝集试验进行了鉴定，具体步骤如下：

(1)PCR方法鉴定：根据参考文献合成猪链球菌通用引物和猪链球菌7型特异性引物。其中猪链球菌通用引物JP4和JP5是根据谷氨酸盐脱氢酶基因(gdh，基因登录号：gb|EF539838.1|)设计，

上游引物为JP4(5’-CCATGGACAGATAAAGATGG-3’)；

下游引物为JP5(5’-GCAGCGTATTCTGTCAAACG-3’)，可扩增长度为689bp的目的DNA片段(其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所述，其PCR图片见图2)。

猪链球菌7型的特异性引物是根据猪链球菌具有型特异性的荚膜多糖抗原基因cps7(基因登录号：gb|FJ572226.1|)设计，上游引物为cps7-F(5’-AGCTCTAACACGAAATAAGGC-3’)，

下游引物为cps7-R(5’-GTCAAACACCCTGGATAGCCG-3’)，可扩增长度为252bp目的DNA片段(其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所述，PCR图片如图3)。