[发明专利]一种BK病毒的检测方法、其试剂盒及应用

权利要求书

1.一种BK病毒的检测方法，其特征在于，所述的检测方法包括以下步骤：

(1)针对BK病毒基因组设计特异性引物BKV-F和BKV-R，Taqman荧光探针BKV-P，Taqman荧光探针BKV-P的5’端标记有荧光基团，在除5’端外的任意一个位置上标记有淬灭基团，优选连接于3’端；

(2)处理待测样本，进行PCR反应；

(3)通过荧光定量PCR仪检测反应结果；

其中，BKV-F的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，或由SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列经取代、缺失、添加形成的核苷酸序列；

BKV-R的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，或由SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列经取代、缺失、添加形成的核苷酸序列；

BKV-P的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，或由SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列经取代、缺失、添加形成的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的Taqman荧光探针的荧光报告基团选自由6-羧基荧光素、六氯-6-甲基荧光素、VIC荧光染料、四氯-6-羧基荧光素、羧基-X-罗丹明、6-羧基四甲基罗丹明、磺酰罗丹明、6-羧基-4’，5’-二氯-2’，7’-二甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酯、花菁3、花菁5或花菁5.5中的至少一种；所述荧光淬灭基团选自6-羧基四甲基罗丹明、4-(4-二甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸、黑洞淬灭剂1、黑洞淬灭剂2或黑洞淬灭剂3中的至少一种；

优选的，当荧光淬灭基团选自4-(4-二甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸时，荧光报告基团选自6-羧基荧光素、四氯-6-羧基荧光素、6-羧基-4’，5’-二氯-2’，7’-二甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酯、六氯-6-甲基荧光素、花菁3中的至少一种；

当荧光淬灭基团选自6-羧基四甲基罗丹明时，荧光报告基团选自6-羧基荧光素、四氯-6-羧基荧光素、6-羧基-4’，5’-二氯-2’，7’-二甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酯或六氯-6-甲基荧光素中的至少一种；

当荧光淬灭基团选自黑洞淬灭剂1时，荧光报告基团选自6-羧基荧光素、四氯-6-羧基荧光素、6-羧基-4’，5’-二氯-2’，7’-二甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酯、六氯-6-甲基荧光素或花菁3中的至少一种；

当荧光淬灭基团选自黑洞淬灭剂2时，荧光报告基团选自6-羧基四甲基罗丹明、花菁3、羧基-X-罗丹明或磺酰罗丹明中的至少一种；

当荧光淬灭基团选自黑洞淬灭剂3时，荧光报告基团选自花菁5或花菁5.5中的一种；最优选的，所述荧光报告基团为6-羧基荧光素；所述荧光淬灭基团为黑洞淬灭剂1。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中PCR反应的反应体系包括：PCR反应液19.8μl、DNA聚合酶0.2μl和待检模板5.0μl；

其中，PCR反应液的组成为：10×反应缓冲液2.5μl，BKV-F(10μM)0.5μl，BKV-R(10μM)0.25μl，BKV-P(10μM)0.5μl，dNTP 2.0μl，最后用无菌超纯水将反应体系补至19.8μl。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中PCR反应的反应条件为：92～95℃，3～5分钟；92～95℃，10～15秒，55～65℃，10～35秒，共40个循环；优选为：94℃，4分钟；94℃，15秒，60℃，35秒，共40个循环。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中的PCR反应设置阴性质控组和BK病毒定量标准品I～IV组，其中阴性质控组的待测模板为纯水，BK病毒定量标准品I～IV的待测模板分别为BKV定量标准品I、BKV定量标准品II、BKV定量标准品III、BKV定量标准品IV。

6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，BKV定量标准品I～IV的构建方法包括以下步骤：

(1)配制检测反应体系，加入提纯的病毒基因组，进行PCR反应；

(2)将扩增产物插入T载体构建重组质粒，重组质粒转化细菌后扩增；

(3)提纯重组质粒后利用紫外分析法测定吸光度，计算质粒浓度，最后将重组质粒稀释成4个梯度5×10⁵～5×10⁸copies/ml，分别作为试剂盒的BKV定量标准品I-IV。