[发明专利]基于HepG2稳定表达HBV野生株细胞系及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属微生物动物细胞系领域，具体涉及一种基于HepG2稳定表达HBV野生株细胞系，尤其涉及一种高表达野生型HBV病毒肝癌细胞株(HepG2.HSWT)及其制备方法。 

背景技术

本领域公知，HBV细胞模型是筛选抗药物、研究其生物学特点及其与细胞间相互作用的必要工具。尤其在研究有关肝疾病的发病机制、免疫机制、抗病毒药物的筛选中具有重要作用；其中，Hep2.2.15细胞是HBV细胞模型开发研究的里程碑，有研究显示，其用含2个HBV头对尾二聚体的pDolt-HBV-1重组载体转染HepG2细胞，经G418筛选后获得一个产高水平HBsAg和HBeAg的细胞克隆，其胞内外均能检测到HBV-DNA以及具有感染性的完整病毒颗粒。迄今，Hep2.2.15仍是相关领域应用最为广泛的HBV细胞模型。 

然而，HepG2.2.15在HBV研究方面仍存在下述缺陷：(1)HepG2.2.15HBV蛋白如HBsAg、HBeAg表达水平相对较低，不利于相关病毒蛋白的研究，且与HBV-DNA一样，其表达水平不稳定，受培养环境等因素影响较多；(2)其整合的HBV基因型非B、C基因型，对于研究中国人群HBV发病或耐药机制方面的研究存在相当的局限性。鉴于中国是肝炎发病大国，Hep2.2.15显然已经不能完全满足目前相关的研究，国内目前的有关研究需要良好的HBV细胞模型和实验平台。 

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的缺陷和不足，提供一种基于HepG2稳定表达HBV野生株细胞系，尤其涉及一种高表达野生型HBV病毒肝癌细胞株(HepG2.HSWT)及其制备方法。 

本发明的细胞系有利于中国人群HBV发病或耐药机制方面的深入研究，可进一步用于筛选抗HBV药物、研究HBV生物学特点及其与细胞间相互作用的HBV细胞模型的建立。 

本发明的基于HepG2稳定表达HBV野生株细胞系，能持续表达HBsAg及HBeAg，胞 内有HBV复制，并可产生HBV颗粒；与所述的的Hep2.2.15细胞相比，本发明的细胞系表达HBsAg及HBeAg明显高于Hep2.2.15，细胞上清HBV颗粒水平与Hep2.2.15基本持平。 

本发明尤其提供了一种高表达野生型HBV病毒肝癌细胞株(HepG2.HSWT)，所述的细胞株HepG2.HSWT其整合的HBV基因型为B或C基因型；该细胞株对LAM及ADV均敏感；HBV胞内复制水平随LAM及ADV浓度上升逐步下降。 

本发明将HBV真核表达质粒pREP-HBV-WT转染HepG2细胞后，通过潮霉素筛选，然后检测细胞中HBV复制、特异性抗原的表达及病毒颗粒的产生，并与Hep2.2.15细胞株相比较，最终建成基于HepG2稳定表达HBV野生株细胞系，获得高表达野生型HBV病毒肝癌细胞株HepG2.HSWT，已于2011年6月1日保藏，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCC No.4909，分类命名：人肝癌细胞株HepG2.HSWT。 

本发明中，所述的HBV真核表达质粒pREP-HBV-WT，来源于福建医科大学分子病毒实验室； 

所述质粒的载体骨架为pREP10载体，该载体的优势在于潮霉素Hygromycin抗性基因有利于细胞筛选工作以及EBNA-1基因转录蛋白能够上调含OriP复制原点的真核表达质粒中基因转录和表达； 

所述HBV复制子为含cp启动子以及完整HBV前基因组的HBV1.2倍体(B型，GeneBank登录号AF100309)，插入切除RSV启动子的pREP10，构建成HBV真核表达质粒pREP-HBV-WT。 

本发明的细胞株具有以下生物学特性：能持续表达HBsAg及HBeAg，胞内有HBV复制，并可产生HBV颗粒；与目前广泛使用的Hep2.2.15相比，其表达HBsAg及HBeAg明显高于Hep2.2.15，细胞上清HBV颗粒水平与Hep2.2.15基本持平，该细胞株整合的HBV基因型为B或C基因型；其对LAM及ADV均敏感；HBV胞内复制水平随LAM及ADV浓度上升逐步下降。 

本发明的高表达野生型HBV病毒肝癌细胞株(HepG2.HSWT)通过下述方法和步骤制备： 

(1)质粒转染HepG2细胞 

①细胞培养：HepG2细胞以DMEM培养液培养；