[发明专利]一种与兔出血症病毒VP60蛋白相结合的蛋白及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种可以与兔出血症病毒外壳蛋白VP60相互结合的蛋白质及其应用，特别涉及一种膜突蛋白MSN，及其在制备治疗兔出血症药物中的应用，属于生物医药领域。 

背景技术

兔出血症(Rabbit Hemorrhagic Disease，RHD)，俗称“兔瘟”(Rabbit Plague)，是由兔出血症病毒(Rabbit Hemorrhagic Disease Virus，RHDV)引起的急性、烈性、接触性传染病，以肝坏死、实质脏器水肿、呼吸系统及全身多器官淤血及出血性变化为主要特征，对养兔业通常造成毁灭性的打击。VP60作为病毒的唯一外壳蛋白，历经毒株20多年的流行，仍然保持着高度的同源性，其在疾病的感染和宿主免疫方面具有重要的作用。 

病毒在肝脏内快速大量繁殖，导致致死性肝炎的发生，表明肝脏组织中存在多种与兔出血症病毒相互作用的蛋白，因此从兔肝脏中筛选兔出血症病毒VP60蛋白的相互作用蛋白，在本病的预防、治疗等方面具有重要意义。 

膜突蛋白(Moesin，MSN)，在细小病毒、逆转录病毒以及慢病毒(艾滋病病毒)的繁殖、传播中具有重要作用，但是MSN其是否能够参与RHDV的的繁殖和传播尚无报道。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题之一是提供一种可用于制备兔出血症药物的蛋白质或核酸，本发明的一种与兔出血症病毒VP60蛋白相互结合的蛋白，其特征在于至少包含如SEQ ID NO：1所示的序列； 

经测序以及序列比对分析发现，该蛋白为一种膜突蛋白MSN，而目前尚没有将膜突蛋白MSN用于治疗兔出血症的报道； 

优选的，所述蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。 

本发明还提供了编码以上所述蛋白的核苷酸序列； 

优选的，所述的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示； 

本发明还涉及了含有所述的核苷酸序列的重组载体、含有所述的重组载体的宿主菌，宿主菌可为大肠杆菌(大肠埃希氏菌，Escherichia coli)BL21(DE3)。 

本发明所要解决的技术问题之二是提供一种治疗兔出血症的药物组合物，包括有效剂量的所述的蛋白和药学上接受的载体；及 

一种治疗兔出血症的药物组合物，包括有效剂量的所述的核苷酸序列和药学上接受的载体 

本发明所要解决的技术问题之三是提供以上所述的蛋白在制备治疗兔出血症药物中的应用；及 

所述的核苷酸序列在制备治疗兔出血症药物中的应用。 

本发明所要解决的技术问题是通过以下方法实现的： 

1、从兔肝脏组织cDNA文库中钓取得到与兔出血症病毒结构蛋白VP60相互作用的蛋白 

在本项研究中，通过酵母双杂交技术，从兔肝脏组织cDNA文库中钓取得到与兔出血症病毒结构蛋白VP60相互作用的蛋白。经测序以及序列比对分析发现，该蛋白为膜突蛋白MSN(XM_002720059.1)。 

2、膜突蛋白MSN蛋白的主要编码基因片段的克隆及表达 

克隆了MSN蛋白的主要编码基因片段(687nt-2156nt)，长1470bp。将此段基因序列连接到表达载体pET30a中，获得重组质粒pMSN，转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得了重组MSN蛋白，该蛋白氨基酸序列长490aa，分子量约57.5kD。 

3、膜突蛋白MSN蛋白与病毒粒子结合的体外验证 

通过免疫共沉淀试验，体外验证了MSN蛋白具有和病毒粒子相互结合的功能，纯化的MSN蛋白在1.15μg的条件下，可以抑制8个血凝单位的病毒抗原对人“O”型血红细胞的凝集作用。 

4、膜突蛋白MSN蛋白病毒中和试验 

以该蛋白质与16倍半数致死剂量的RHDV室温内孵育60min，经口服、滴鼻接种RHDV抗体阴性兔，8天后兔仍然存活，外表健康，病理解剖及切片检查各脏器也无异常。病毒感染兔，于3日内死亡。该膜突蛋白MSN可以用于RHDV的感染中的防治。 

附图说明

图1为重组膜突蛋白MSN蛋白对RHDV的血凝抑制效果； 

图2为病理切片观察结果； 

图3为血凝试验结果； 

图4为兔肝酵母cDNA文库插入片段的琼脂糖凝胶电泳图； 

1-20：PCR产物；M：DL2000Marker 

图5为重组质粒pGBKT7-VP60的PCR鉴定图；