[发明专利]一种用于体外评价中药注射剂潜在致敏性的实验方法

说明书

技术领域

本发明涉及药物评价方法领域，具体涉及一种用于体外评价中药注射剂潜在致敏性的实验方法。

背景技术

随着中药现代化程度的提高，中药注射剂近年来有了很大发展，但随之而来的安全性问题也日益严重。临床前安全性评价方法中，中药注射剂过敏性试验包括主动全身过敏试验(ASA)和被动皮肤过敏试验(PCA)，主要针对I型过敏反应，但绝大部分中药注射剂在新药临床前申报资料中过敏性试验结果均为阴性，与上市后临床使用中存在的过敏反应高阳性率存在较大的差异，这种差异提示传统过敏性试验可能存在缺陷，因此，寻找更有效、灵敏的评价方法是目前亟待解决的关键问题。

发明内容

本发明提供了一种用于体外评价中药注射剂潜在致敏性的实验方法，该方法对于中药注射剂的潜在致敏性的判定直观、稳定、可靠。

一种用于体外评价中药注射剂潜在致敏性的实验方法，包括步骤：

(1)采用大鼠嗜碱性细胞白血病细胞(RBL-2H3细胞)建立中药注射剂潜在致敏性体外评价模型；

(2)用透射电镜观察、计算脱颗粒指数、Annexin V阳性细胞率、β-己糖胺酶释放率中的一种或两种以上指标判定中药注射剂的潜在致敏性。

所述的中药注射剂潜在致敏性体外评价模型的构建为：大鼠嗜碱性细胞白血病细胞传代培养。所述的传代培养的方法采用现有的细胞传代培养方法。

所述的脱颗粒指数采用常规形态学方法检测。

所述的Annexin V阳性细胞率采用流式细胞术测定。

所述的β-己糖胺酶(即β-氨基己糖苷酶)释放率采用分光光度法测定。

本发明用于体外评价中药注射剂潜在致敏性采用了RBL-2H3细胞来建立细胞模型。RBL-2H3细胞是商品化的大鼠嗜碱粒细胞肿瘤株，表面有高亲和力IgE受体，活化后可以发生脱颗粒反应，由于其具有永生化特性，培养方法简单，生长迅速，避免了从血液中梯度分离嗜碱粒细胞时操作繁琐或细胞纯度、数量不足等弊端，是建立体外检测系统的最佳选择。

本发明用于体外评价中药注射剂潜在致敏性采用了测定Annexin V阳性率的方法。Annexin V曾被广泛用于结合凋亡过程中质膜上的磷脂酰丝氨酸。许多实验证实Annexin V参与胞吐过程。1999年，Demo首次报道用Annexin V来标记脱颗粒的肥大细胞，结果显示，Annexin V特异性地与细胞表面的分泌颗粒结合，结合程度与β-己糖胺酶释放成正比。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

本发明将从脱颗粒指数、组胺释放率、Annexin V阳性率、β-己糖胺酶释放率等目前常用指标确定RBL-2H3细胞体外评价模型各项参数，建立方便快捷的中药注射剂临床前安全性评价或临床应用不良反应预测的有效平台。

附图说明

图1为实施例2中Annexin V阳性率与CA浓度的关系图；

图2为实施例2中对照组的流式散点图；

图3为实施例2中CA浓度为0.2mmol·L^-1药物组的流式散点图；

图4为实施例2中CA浓度为1.0mmol·L^-1药物组的流式散点图；

图5为实施例2中CA浓度为5.0mmol·L^-1药物组的流式散点图；

图6为实施例4中阴性对照组RBL-2H3细胞的透射电镜图；

图7为实施例4中阳性对照组RBL-2H3细胞的透射电镜图；

图8为实施例4中CA浓度为0.2mmol·L^-1药物组RBL-2H3细胞的透射电镜图；

图9为实施例4中CA浓度为1.0mmol·L^-1药物组RBL-2H3细胞的透射电镜图；

图10为实施例4中CA浓度为5.0mmol·L^-1药物组RBL-2H3细胞的透射电镜图。

具体实施方式

本发明结合具体实施例进一步说明如下：

实施例1