[发明专利]一种检测己烯雌酚的免疫层析试纸及其制备方法

权利要求书

1.一种检测己烯雌酚的免疫层析试纸，包括含有超顺磁性复合粒子标记己烯雌酚抗体的样品垫、连接于所述样品垫一端的反应垫、连接于所述反应垫另一端的吸水垫；所述反应垫包被有相互分离的检测线和质控线，所述检测线含有己烯雌酚抗原，所述质控线含有能与所述己烯雌酚抗体特异结合的抗抗体。

2.根据权利要求1所述的试纸，其特征在于：

所述反应垫为硝酸纤维素膜；

所述超顺磁性复合粒子标记己烯雌酚抗体为己烯雌酚抗体和超顺磁性复合粒子的肽键共价结合形成的聚合体；

所述己烯雌酚抗体为己烯雌酚单克隆抗体或己烯雌酚多克隆抗体，所述己烯雌酚抗体具体为己烯雌酚单克隆抗体；

所述己烯雌酚抗原为己烯雌酚半抗原与载体蛋白的偶联物；

所述载体蛋白与己烯雌酚半抗原的偶联比为1∶8～1∶10，具体为1∶10；

所述与所述己烯雌酚抗体特异结合的抗抗体为羊抗鼠IgG抗体；

所述己烯雌酚抗原和所述羊抗鼠IgG抗体的浓度均为1mg/ml。

3.根据权利要求1或2所述的试纸，其特征在于：

所述超顺磁性复合粒子标记己烯雌酚抗体按照如下方法制备：

1)将每2.5mg超顺磁性复合粒子、0.96mg1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺、1.15mg N-羟基丁二酰亚胺和1ml浓度为0.1M、pH值为4.7的2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液混匀，反应，得到活化后磁性粒子；

2)将每2.5mg步骤1)得到活化后磁性粒子、0.15mg己烯雌酚抗体和0.8ml浓度为50mM pH为8.5的硼砂缓冲液混匀、反应，得到含有偶联后磁性粒子的反应液；

3)向步骤2)得到的反应液中加入BSA混匀得到混合液、反应，得到含有封闭后磁性粒子的反应液；

所述BSA在所述混合液中的浓度为5％(质量百分含量)。

所述己烯雌酚抗原按照如下方法制备：

A)先取每26.8mg己烯雌酚、20mg琥珀酸酐和5ml吡啶混匀，反应，得到反应液a，再除去所述反应液a中吡啶，得到DES中间体；再加入5mlN，N-二甲基甲酰胺溶解82mg所述DES中间体，得到DES中间体溶液；

B)将每5ml步骤A)得到的DES中间体溶液和26.2μl三丁基正胺混和，得到反应液b，再向所述反应液b中加入1.5μl氯甲酸异丁酯混匀、反应，得到活化后的DES中间体溶液；

C)取每100mg载体蛋白溶解于10ml浓度0.1mol/L，pH为8.5的硼酸钠水溶液中得到载体蛋白硼酸溶液；

D)将每5ml步骤B)得到的活化后DES中间体溶液和10ml步骤C得到的载体蛋白硼酸溶液混匀、反应，得到反应液c。

4.根据权利要求1-3中任一所述的试纸，其特征在于：

所述超顺磁性复合粒子标记己烯雌酚抗体的制备方法中：

步骤1)中，反应温度为37℃，反应时间为0.5h；

步骤2)中，反应温度为25℃，反应时间为3.5h；

步骤3)中，反应温度为37℃，反应时间为0.5h。

所述己烯雌酚抗原的制备方法中：

步骤A)中，所述反应温度为45℃，所述反应时间为15h；

步骤B)中，所述混合温度为4℃，所述混合时间为1h；所述反应温度为25℃，所述反应时间为1h；

步骤D)中，所述反应温度为4℃，所述反应时间为12h。

5.根据权利要求1-4中任一所述的试纸，其特征在于：

所述超顺磁性复合粒子标记己烯雌酚抗体的制备方法中：

在所述步骤3)后，还包括将所述含有封闭后磁性粒子的反应液中的封闭后磁性粒子进行洗涤、悬浮，得到超顺磁性复合粒子标记己烯雌酚抗体的步骤，所述洗涤液和悬浮液均为浓度为0.02M pH为7.4的PBS缓冲液。

所述己烯雌酚抗原的制备方法中，

在所述步骤D)后还包括将步骤D)得到的反应液c经透析、纯化、冻干，得到己烯雌酚抗原的步骤。