[发明专利]一种乌梢蛇PCR检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及中药及中药材鉴定技术领域，特别涉及一种能够快速鉴定乌梢蛇的PCR检测试剂盒。主要用于乌梢蛇药材、含有乌梢蛇的制剂以及乌梢蛇活体材料的快速鉴定。

背景技术

乌梢蛇为《中国药典》(2005版)一部收载的一种常用中药，来源于游蛇科动物乌梢蛇Zaocys dhumnades Cantor的干燥体。有祛风、通络、止痉之功效，用于风湿顽痹，麻木拘挛，半身不遂，抽搐痉挛，瘰疠恶疮。

鉴于乌梢蛇作为中药的临床功效确切，但商品来源复杂、药材形态鉴别困难的现状，我们在收集药材的同时，对市场上乌梢蛇药材流通情况进行了调查。商品流通中多以红点锦蛇、黑眉锦蛇、玉斑锦蛇、王锦蛇、灰鼠蛇等来混作正品药材进行销售(王义权，周开亚.蛇类药材的商品调查及鉴定.中药材1996，19(6)：285)，这些品种多数与乌梢蛇同科不同属，因其来源相近，造成鉴定困难。此外，药材在加工处理时剖去内脏后，要进行干燥熏黑处理，皮上的花纹特征、颜色几近消失，难以辨认，而且其大小、形态特征与乌梢蛇相近，这是造成其性状鉴别困难的另一重要原因。我们已于2004年3月1日申报了“高特异性聚合酶链式反应技术鉴别中药材乌梢蛇真伪的方法”的发明专利(专利号：200410006374.0)。由于专利中的DNA提取等方法操作具有一定的专业性，同时需要大量的配制试剂的时间，因此，在推广应用上存在一定的困难。同时，在以往的中药材PCR分子鉴别中，很少设置PCR阳性和阴性对照或仅仅用相应药材提取的总DNA用做对照，这样导致PCR鉴别的准确率得不到有效的控制。本专利则在上述专利的基础上，将所有需要应用到的试剂集成为一个试剂盒，利用此试剂盒进行乌梢蛇的鉴别时，不须再配制任何试剂，而且操作人员无须特殊培训即可掌握操作，同时，以含有正品和伪品鉴别引物在内相应片段的质粒DNA作为PCR的阳性和阴性对照，从而极大提高了PCR鉴别的准确性，为乌梢蛇PCR鉴别的推广应用奠定了坚实的基础。在本发明被公布之前，尚未有任何专门用于乌梢蛇鉴别的PCR试剂盒和相应的PCR对照品。

发明内容

本发明试剂盒包括DNA提取系统、PCR扩增系统和琼脂糖凝胶检测系统。

其中DNA提取系统包括细胞核裂解液I，裂解缓冲液II，洗脱液，RNase酶溶液，蛋白酶K、灭菌双蒸水、离心柱和离心管。

PCR扩增系统包括2×Taq PCR Mix，检测用引物、阳性对照品和阴性对照品和灭菌双蒸水。

琼脂糖凝胶检测系统包括琼脂糖，50×TAE缓冲液、100bp DNA分子量标准、GelRed^TM核酸凝胶染色剂。

检测用引物为：WS-F 5’GCGAAAGCTCGACCTAGCAAGGGGACCACA3’和WS-R 5’CAGGCTCC TCTAGGTTGTTATGGGGTACCG3’。

质控标准品中阳性对照品为含有乌梢蛇12S片段SEQ ID.5的载体pGEM-WS，阴性对照品为含有乌梢蛇伪品灰鼠蛇12S相应片段SEQ ID.6的载体pGEM-HS。

本试剂盒不同成分应按要求分别存放于-20℃、4℃和室温。存放于-20℃的成分应尽量减少反复冻融。

本发明建立了利用PCR技术检测乌梢蛇真伪的试剂盒，利用所提供的试剂盒，不需单独配制任何试剂，操作人员无须特殊培训即可掌握PCR鉴别的方法，为PCR技术广泛应用于药用动植物的检测提供了实用的技术。

附图说明

图1乌梢蛇PCR对照品特异性检测

1.乌梢蛇总DNA为模板2.pGEM-WS质粒为模板3.pGEM-HS质粒为模板

图2乌梢蛇药材及其混淆品PCR鉴别结果

1.阳性对照 2.乌梢蛇 3.虎斑颈槽蛇 4.三索锦蛇 5.双全白花蛇 6.灰鼠蛇 7.滑鼠蛇 8.红点锦蛇 9.王锦蛇 10.赤链华游蛇 11.中国水蛇 12.短吻蝮蛇 13.百花锦蛇 14.眼镜蛇 15.赤练蛇 16.铅色水蛇 17.金环蛇 18.山烙铁头蛇 19.黑眉锦蛇 20.环纹华游蛇 21.蕲蛇 22.金钱白花蛇 23.玉斑锦蛇 24.空白 M.marker(2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)(下同)

图3 10个不同批次的乌梢蛇药材PCR鉴别结果

1.阳性对照2-11.乌梢蛇 12.阴性对照 13.空白

图4 10个不同批次的乌梢蛇炮制品PCR鉴别结果