[发明专利]山羊毛囊外根鞘细胞系的构建方法

说明书

 

一、技术领域

本发明涉及山羊毛囊外根鞘细胞系的构建方法，属于细胞生物学领域。

二、技术背景

毛囊（Hair follicle）是表皮向真皮凹陷后形成的能控制毛发生长的皮肤附属器官，是由胚胎期神经外胚层与间充质相互作用，最终发育形成的由多层细胞组成的、具有合成多种特异角质蛋白功能的复杂的动态器官，具有独特的结构和周期性再生的能力。毛囊在形成与分化过程中至少涉及到20余种不同的细胞群，主要由毛乳头、毛母质、内根鞘和外根鞘等细胞组成。其中，外根鞘细胞（Outer root sheath cell, ORSC）作为一种重要的毛囊上皮细胞，因具有高度增生的潜能，在毛发再生、伤口愈合、初级毛囊和次级毛囊分化等生理过程中均起着重要作用，因而越来越受到高度关注。

自Wetering 等（1981）利用经钴源照射后的牛晶状体包膜囊作为支持物，成功诱导人毛囊外根鞘细胞迁移出游离毛囊以来，已有不少学者针对ORSC体外培养体系与技术进行过改进。其中，Well等（1982）将分离的毛囊直接接种到塑料培养皿中，在控制培养液pH不高于7.2的条件下，贴壁毛囊周围便可游离出外根鞘细胞，但该方法获得的外根鞘细胞产量低且再生能力差，不便于进行进一步的研究与大量的应用。迄今，已有多种细胞分离技术和细胞培养方法运用于ORSC的体外培养，其中，较为常用的培养方法有两种：一种是将分离的毛囊经胰蛋白酶消化处理后，用含10%胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS）的DMEM/F12培养液制成细胞悬液，然后接种于经丝裂霉素处理的3T3细胞滋养层上，37℃、5%CO₂条件下进行原代培养（Rheinwald K. et al., 1985; Limat A. et al., 1986; Sabolinski M. L. ea al., 1996; Naughton G. et al., 1997; McElwee K. J. et al., 2003; 唐建兵等，2005）；另一种则是利用胶原包埋法进行外根鞘细胞的培养：分离带有外根鞘部位的毛囊，37℃下进行胰酶消化处理，随后将毛囊转移至Ⅰ型和Ⅳ型胶原包被的塑料培养皿中，加入含有10%FBS的DMEM培养液进行培养，待毛囊牢固贴附于培养皿底壁后，换用无血清的DMEM培养液进行培养（Detmar M. et al., 1993; Sotaro K. et al., 1994; Limat A. et al., 1996; Schirren C.G. et al., 1997; Oshima H. et al., 2001; Juergen S. et al., 2008; 伍津津等，2008）。以上两种方法虽均能获得毛囊外根鞘细胞，但仍存在少量非外根鞘细胞，且细胞传至8~10代后出现凋亡现象，以致无法继续进行传代培养。

上述外根鞘细胞的培养多以人的毛囊为细胞的组织来源。对于其它哺乳动物ORSC的培养，主要借鉴人毛发外根鞘细胞培养方法。研究表明，将分离得到的小鼠触须毛囊接种于含有表皮生长因子（Epidermal growth factor，EGF）及10%FBS的RPMI1640培养基中，且细胞培养板预先用经丝裂霉素C处理的表皮细胞滋养层覆盖，可成功分离得到纯一的ORSC并稳定生长至8~10代（Jahoda CA. et al., 2001; 钟白玉等，1999；高强国等，2004）。亦有学者在上述分离培养方法的基础上加以改进，成功分离培养了大鼠、牛、羊驼、猪、兔等动物的毛外根鞘细胞及其它毛囊细胞（Tsuyoshi H. et al., 2001; Miyashita H. et al., 2004; Christiano AM. et al., 2004; 陈大元等，1999；魏泓等，2004；李键等，2007）。尽管许多学者在动物毛囊细胞培养方面进行了大量的研究，但有关山羊毛囊细胞体外培养研究，尤其是外根鞘细胞系建立等方面的报道相对较少，可应用于动物毛囊研究方面的细胞株与细胞系亦不多。因此，有必要建立体外培养毛囊外根鞘细胞系和完善培养方法，为进一步开展毛囊细胞的生长、发育、分化等研究建立离体细胞模型。

三、发明内容

技术问题