[发明专利]一种依替巴肽的液相合成方法

说明书

技术领域

本发明涉及多肽合成技术领域，尤其涉及一种依替巴肽的液相合成方法。

背景技术

依替巴肽由七个氨基酸或氨基酸衍生物残基组成，含有修饰了的KGD序列，以分子内二硫键成环，对GP IIb/IIIa受体有高度的亲和力和特异性。依替巴肽于1998年在美国上市，商品名Integrilin，作为抗血小板凝聚集药物用于急性冠动脉综合症(Acute Coronary Syndrome，ACS)的治疗，是对Barbourin进行结构改造开发出的应用于临床的药物，其机理是通过抑制血小板聚集，具体通过阻断血小板受体GPIIb/IIIa而起作用的。血小板的聚集可阻碍血液向心脏的供应，引起不稳定心绞痛并且可能引起心肌梗塞。依替巴肽对血小板有物资，避免了其它常用心血管方法的干扰，且信用后可消除其作用效果，因而其临床应用越来越广泛。

依替巴肽的合成方法主要可以分为固相合成方法和液相合成方法，液相合成方法主要是通过多肽片段合成来实现的。

美国专利US5318899、US5686570、US5747447、WO2005121164、WO2006045483A2和WO2006119388A2等均介绍了采用固相方法合成依替巴肽。WO2005121164中介绍的固相方法合成依替巴肽是先将保护的Cys衍生物连接到固相载体上，通过常规的固相多肽合成方法制备得到Mpr(Acm)-Lys(Boc)-Gly-Asp(OtBu)-Trp-Pro-Cys(Acm)-Resin，之后采用裂解试剂可以将其从树脂上切割下来。通过将Lys转变成高精氨酸可以得到两个巯基均采用Acm保护的依替巴肽前体，最后采用碘氧化可以在脱除Acm保护基的同时形成分子内二硫键，从而得到依替巴肽。采用固相多肽合成方法通常可以将依替巴肽前体肽粗品从树脂上裂解下来之后进行氧化环化进而得到依替巴肽，也有专利介绍采用一定的方法可以使依替巴肽前体在树脂上形成二硫键，从而在将其从树脂上裂解下来即可以得到依替巴肽。固相多肽方法合成依替巴肽时使用的氨基酸的过量倍数较大(通常4-5倍)，同时在合成过程中要采用DMF等溶剂洗剂树脂，不能分离得到中间肽，只能在液相中环化成依替巴肽后采用RP-HPLC方法对其进行纯化，中间没有分离纯化过程，这意味着其合成成本会非常高，而作为一个仅含有7个氨基酸的多肽，可以采用液相合成方法对其进行合成。

通常认为大规模生产依替巴肽时液相合成方法比固相合成方法更可行。首先，液相合成过程中会不断分离出中间体，每一步得到的中间体的纯度都比较高，通过控制中间体的纯度等可以保证成品的质量；其次，与固相多肽合成方法相比，液相多肽合成方法可以节省比较多的溶剂成本，对于企业而言更具有优势；再次，由于依替巴肽肽链不长，在采用液相合成方法的时候遇到溶解性的问题会比较小，因而可以制备大量中间体，从而为依替巴肽工业化生产奠定良好的基础。专利中也介绍了大量的液相合成依替巴肽的方法，如专利US7674768等。

发明内容

本发明提供了一种液相制备依替巴肽的方法，其特征在于首先合成两条三肽链，二者缩合形成六肽之后与Cys衍生物反应得到依替巴肽前体，经过环化后可以得到依替巴肽；

本文明的特定方法包括如下步骤：

1)液相合成片断1：Mpa(X)-Har(Y)-Gly-OH；

2)液相合成肽段2：R1-Asp(R2)-Trp(R3)-Pro-OH；

3)将肽段1和肽段2缩合，制得合保护肽段3：

Mpa(X)-Har(Y)-Gly-Asp(R2)-Trp(R3)-Pro-OH；

4)将肽段3与H-Cys(R4)-NH2缩合，制得肽段4：

Mpa(X)-Har(Y)-Gly-Asp(R2)-Trp(R3)-Pro-Cys(R4)-NH2；

5)将肽段4脱保护基，得到线性肽：

Mpa(X)-Har-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys(R4)-NH2或

Mpa(X)-Har-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys-NH2或

Mpa-Har-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys(R4)-NH2或

Mpa-Har-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys-NH2；

6)将线性肽氧化环合成二硫键，制得依替巴肽：

其中，

Mpa是巯基丙酸；

Har是高精氨酰基；

Gly是甘氨酰基；

Asp是天冬酰基；

Trp是色氨酰基；

Pro是脯氨酰基；