[发明专利]猪小肠抗菌肽PR-39在毕赤酵母中的高效生产方法及应用

权利要求书

1.一种猪小肠抗菌肽PR-39在毕赤酵母中的高效生产方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）根据GenBank [GI:242304] 上发表的抗菌肽PR39 氨基酸序列，选用毕赤酵母偏嗜性密码子，设计4条互为模板的引物，PCR合成编码PR-39的DNA序列，连接表达载体pGAPZα-A，构建pGAPZα-A-PR-39真核表达载体；所述引物P1、p2、P3和P4分别具有SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示的核苷酸序列；

（2）重组表达载体pGAPZα-A-PR-39转化宿主细胞毕赤酵母，构建表达工程菌；

（3）发酵培养重组酵母菌，进行表达，得表达产物；

（4）将步骤（3）所述表达产物离心处理得到纯化的猪小肠抗菌肽PR-39。

2.根据权利要求1所述猪小肠抗菌肽PR-39在毕赤酵母中的高效生产方法，其特征在于步骤（2）是将80μL的感受态P.pastoris SMD1168与10 μg的 Avr II线性化的pGAPZα-A-PR-39相混合，电击，将转化后的酵母细胞培养至单菌落出现，制备PCR 模板分析P.pastoris转化子，以P1、P4为引物扩增出142 bp 的克隆定为阳性转化子，筛选具有Zeocin 抗性的单菌落。

3.根据权利要求1所述猪小肠抗菌肽PR-39在毕赤酵母中的高效生产方法，其特征在于步骤（3）是挑选具有Zeocin 抗性的单菌落，挑于YPD 液体培养基中进行一级培养至OD₆₀₀=2~6；取所述一级培养液重悬于YPD 中继续振荡培养得表达产物。

4.根据权利要求1所述猪小肠抗菌肽PR-39在毕赤酵母中的高效生产方法，其特征在于步骤（4）所述离心处理是将表达产物于3000 r/min 离心5min。

5.一种权利要求1、2、3或4所述方法制备得到的猪小肠抗菌肽PR-39。

6.一种权利要求1、2、3或4所述方法制备得到的猪小肠抗菌肽PR-39的应用，其特征在于应用于制备抗菌药物。