[发明专利]一种应用于喜温硫杆菌的带有氯霉素抗性基因的多拷贝穿梭质粒pSDU1△mob

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学和生物工程技术领域，具体涉及一种带有氯霉素抗性基因和多克隆酶切位点的可在喜温硫杆菌中稳定存在的多拷贝穿梭质粒pSDU1Δmob。 

背景技术

喜温硫杆菌(Acidithiobacillus caldus，简称A.caldus)是一类革兰氏阴性的化能无机营养细菌，从还原性或部分还原性的硫化物的氧化中获得生长所必须的能量和还原力，以卡尔文循环固定空气中的CO₂为碳源。该菌为极端嗜酸性的专性自养菌，最适pH为2-3，在细菌冶金、煤的脱硫和含硫废水的处理等方面有着重要的用途。 

A.caldus以其独特的生活方式和在自然界中的特殊地位，长期以来受到人们的广泛重视，在菌种的分离培养、生理代谢、工业应用等方面做了大量的工作。近年来，随着分子生物学的发展，对硫杆菌中硫代谢及重金属抗性基因在体外进行了大量的表达研究，为利用基因工程的手段对硫杆菌进行改造，使其更好地用于产生奠定了基础。 

发明人的实验室在国际上率先使用接合转移的方法将外源基因通过大肠杆菌转移到氧化硫硫杆菌、氧化亚铁硫杆菌和喜温硫杆菌体内(Jin S，et al.，Appl.Environ.Microbiol.1992，Vol.58，No.1，429-430；Peng J，et al.，J.Bacteriol.1994，Vol.176，No.10，2892-2897；Liu X，et al.，J.Microbiol.Biotechnol.，2007，Vol.17，No.1，162-167)，并成功地建立喜温硫杆菌的电转化方法(Chen L，et al.，J.Microbiol.Biotechnol.，2010，Vol.20，No.1，39-44)。在喜温硫杆菌基因转移系统的研究中发现，其特殊的酸性生长环境，很容易使抗生素失效，液体培养时，质粒上的抗生素抗性基因无法起到有效的筛选作用，导致接合效率及电转效率均较低，且有较多的假阳性转化子菌落出现。因此，寻找理想的抗生素筛选标记，将有助于提高基因转移系统的转化效率，方便实验操作。目前在喜温硫杆菌中广泛应用的穿梭质粒pJRD215多克隆位点较少且大多为不常用酶切位点，操作繁琐，限制了该质粒的使用，该质粒含有接合转移相关基因，使得质粒的拷贝数较低，此外，质粒pJRD215较大(10，316bp)，使得质粒的承载能力较小。因此，构建一个具有理想筛选标记及多克隆位点的多拷贝、小型化穿梭质粒，对喜温硫杆菌的分子生物学研究及基因工程改造具有十分重要的意义。 

发明内容

针对现有质粒的不足，本发明要解决的问题是提供一种可在喜温硫杆菌中应用的带有氯霉素抗性基因的多拷贝、小型化穿梭质粒。 

本发明所述应用于喜温硫杆菌的带有氯霉素抗性基因的多拷贝穿梭质粒，其特征在于，所述质粒命名为pSDU1Δmob，由复制子oriV、自主复制蛋白基因rep、氯霉素抗性筛选基因cat、多克隆酶切位点MCS构成。 

进一步的，上述质粒pSDU1Δmob的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。 

上述质粒pSDU1的构建方法： 

第一，构建可在A.caldus中转录表达的氯霉素抗性基因，第一轮PCR以质粒 pACYC184为模板，使用引物Pr1和Pr2扩增出氯霉素抗性基因的开放阅读框，以第一轮PCR产物为模板，以引物Pr3和Pr2，进行第二轮PCR，引物Pr3中含有质粒pBR322四环素抗性基因P2启动子，通过两轮PCR获得了含有P2启动子的氯霉素抗性基因； 

第二，使用引物(Pr4和Pr5)扩增质粒pJRD215的ori V、rep、mob部分； 

第三，将PCR扩增获得的氯霉素抗性基因和oriV、rep、mob部分，分别用Alw 44 I、EocT 22 I双酶切，纯化后，用T4DNA连接酶连接环化，转化E.coli DH5α，利用氯霉素筛选转化子，提取质粒并进行验证，该质粒为构建过程中的中间质粒，命名为pSDU； 

第四，引入多克隆酶切位点，使用引物Pr6和Pr7，以中间质粒pSDU为模板，进行PCR，将其线性化，引物Pr6、Pr7中分别含有来自质粒pUC19的一部分多克隆位点，PCR产物纯化后用Xba I单酶切，连接转化E.coli DH5α，获得转化子，提取质粒酶切并测序验证，获得了含有多克隆位点的新型质粒，命名为pSDU1；