[发明专利]一种加压素V2受体稳定表达细胞系的建立及其在药物筛选中的应用

说明书

技术领域

本发明属于生物工程领域和医药技术领域，具体涉及一种加压素V2受体稳定表达细胞系及其在药物筛选中的应用。

背景技术

充血性心力衰竭(congestive heart failure，CHF)是指心肌收缩力减弱而引起循环充血的疾病，表现为在心脏受到损害或超负荷工作的状态下，心脏不能有效地输出从体液循环回流的血液，导致心脏容量增加；同时肾脏功能发生障碍，水和纳的排泄减弱，导致水肿和低钠血症，为CHF病人病情恶化的原因之一，严重影响病人的预后，使病人的死亡率增加60％。目前临床上对CHF还没有很好的治疗药物，现有药物可通过增加心血收缩力等来缓解重状，延长生命。研究发现，体内加压素的过量分泌是CHF病人并发低钠血症的病理之一，从而降低加压素的浓度或拮抗它对肾脏的作用成为治疗充血性心力衰竭和低钠血症的研究方向。

加压素又称为抗利尿激素(antidiuretic hormone，ADH)，是脑垂体分泌的一种环肽类激素，在人体调节游离水的重吸收、体液的等渗浓度、血液容积、血压、细胞收缩、细胞增殖和肾上腺皮质激素的分泌等方面扮演重要角色，它的这些生理作都是通过与加压素受体结合而产生的。加压素受体属于G蛋白偶联受体超家族(G-protein coupled protein，GPCR)，根据受体偶联的第二信使的不同可分为3种亚型：V1(或Vla)、V2和V3(或V1b)。其中V2受体偶联于腺苷酸环化酶信号传导路径，以细跑内的cAMP作为第二信使。V2受体主要分布在肾脏的肾集合小管，调节游离水的重吸收。在人体内，加压素通过与V2受体结合，经过Gs蛋白，激活腺苷酸环化酶，提高细胞内作为第二信使的cAMP水平，激活蛋白激酶A，再激活水通道AQP-2，导致游离水通透性增高，水的重吸收增加而产生抗利尿作用。V2受体拮抗剂能特异性拮抗AVP与V2受体的结合，拮抗AVP的抗利尿作用，从而起到利水作用，治疗CHF的低钠血症及相关疾病。

发明内容

本发明的目的是提供一种加压素V2受体稳定表达细胞系的制备方法。

本发明提供的加压素V2受体稳定表达细胞系的制备方法，包括以下步骤：

1)将加压素V2受体基因的编码序列插入到真核表达载体的多克隆位点，得到重组表达载体；

2)将步骤1得到的重组表达载体导入宿主细胞中，筛选得到稳定表达加压素V2受体的细胞系。

上述真核表达载体具体可为pTagLite-Snap、pEGFP-N3等。

为了便于对表达的加压素V2受体进行细胞定位，可在真核表达载体上加入能于宿主中表达并产生颜色变化的酶或发光化合物的基因，如SNAP、GFP、YFP等。

上述宿主细胞可为Hela细胞、MDA-MB-231细胞、MCF-7细胞等。

利用上述方法制备的加压素V2受体稳定表达细胞系也属于本发明的保护范围。

本发明的另一个目的是提供一种筛选预防和/或治疗缺血性脑卒中、心肌梗死等药物的细胞模型。

实验证明，本发明的加压素V2受体稳定表达细胞株对加压素V2受体阻断剂和加压素V2受体抗体敏感，作用显著。本发明的加压素V2受体稳定表达细胞系为深入探索加压素V2受体在血栓形成的作用提供实验技术平台，可用于筛选预防和/或治疗缺血性脑卒中、心肌梗死等药物。

附图说明

图1为重组表达载体pTagLite-Snap-AVPR2的构建流程图

图2为各稳定表达加压素V2受体细胞系的加压素V2受体表达量实验结果

图3为加压素V2受体稳定表达细胞系对加压素V2受体抑制剂的敏感性分析实验结果

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，实施例仅为解释性的，绝不意味着以任何方式限制本发明的范围。

本发明的加压素V2受体稳定表达细胞系的具体构建流程如图1所示。

实施例1.

重组真核表达载体pTagLite-Snap-AVPR2的构建

下述实验过程中所用的DNA引物由上海生工生物技术有限公司合成。

根据加压素V2受体蛋白编码框的cDNA序列，设计PCR引物如下：正向引物：5’ACTGATATCATGCTCATGGCGTCCACCACTTCCG-3’(下划线处为限制性内切酶的识别位点)；反向引物：

5′-AACGAGCTCCGATGAAGTGTCCTTGGCCAGGGAG-3′(下划线处为限制性内切酶的识别位点)。