[发明专利]一种使用纳米材料促进大豆子叶节外植体分化和再生的组织培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及作物种植领域，具体地，涉及一种使用纳米材料促进大豆子叶节外植体分化和再生的组织培养方法。

背景技术

大豆是我国重要的六大作物之一。在大豆生产中，常受到病害、虫害、杂草及干旱等逆境因素的影响，产量很不稳定；虽然常规育种技术在培育高产、稳产、优质、抗逆性强的新品种中发挥了重要作用，但由于受物种杂交不亲和性及与不良基因性状连锁等因素的影响，在引进外源优良基因的同时也带入了某些不需要的不良基因，因而较难进一步利用。基因工程技术在这一方面开辟了一条全新的途径，它可以打破物种界限，按照人类预先设计，实现不同物种间遗传物质重新组合，使某一物种的优良品种引入其它物种优良基因，实现遗传改良简单易行，因此基因工程育种是大豆品质改良和优秀品种选育最直接有效的方法，基因工程技术成为解决农业问题的一条新出路。然而，大豆的遗传转化效率低，体系不稳定限制了大豆基因工程育种的发展，成为急待解决的难题。相关研究数据表明，大豆遗传转化的受体主要有胚轴，胚芽尖，未成熟子叶，子叶节，胚性悬浮培养物，原生质体和子房。其中子叶节法因其相对成熟、易行，而得到了广大专家学者的关注和研究。子叶节的再生过程简单只需经过分化、伸长和生根即可得到再生苗。但是，子叶节法也存在很多弊端，目前报道其转化效率仅为1％-5％，且转化周期较长，工作量大。大豆子叶节转化效率低主要是由于分化频率低，伸长，生根困难两个关键问题造成的。因此找到解决这两个关键问题的方法，建立一套具有较高分化频率，生根容易的组培体系，成为解决大豆遗传转化问题的前提和关键。

碳纳米管(NM)是一种应用较广的纳米材料，具有一些特殊的力学，电学和化学性能。近年来，某些研究表明纳米材料在水稻、玉米、番茄、豌豆等作物的种子萌发及生长中起到了促进作用。

CN101822140中公开使用碳纳米管促进干旱胁迫条件下促进大豆种子萌发的方法，但并未研究碳纳米管对大豆子叶节外植体分化和生长的影响，而种子萌发和子叶分化生长是两种机理不同的生理过程。随着研究的深入，本发明发现将碳纳米管应用于大豆子叶节的组织培养体系，可以提高大豆的再生频率，为大豆分子遗传转化效率的提高提供基础，具有重要的理论意义和实际应用价值。

因此，本发明的发明人首先提出并通过一系列试验，验证了“一种使用纳米材料促进大豆子叶节外植体分化和再生的组织培养方法”，利用本发明的方法可以建立重要大豆品种的高效再生组织培养体系，本发明同时也发现了纳米材料的新用途。

发明内容

因此，本发明的目的是提供一种使用纳米材料促进大豆子叶节外植体分化和再生的组织培养方法。

根据本发明的使用纳米材料促进大豆子叶节外植体分化和再生的组织培养方法包括以下步骤：

1)种子消毒；

2)种子萌发；

3)制备子叶外植体；

4)将得到的外植体置于含有浓度为4mg/L～400mg/L碳纳米管的诱导培养基上，诱导其分化；

5)将分化好的大豆子叶节外植体转入含有浓度为40mg/L碳纳米管的伸长生根培养基；

6)分离组培苗。

优选地，根据本发明的方法，其中，将得到的外植体置于含有浓度为40mg/L～400mg/L、更优选含有浓度为40mg/L碳纳米管的诱导培养基上，诱导其分化，然后移至含有浓度为40mg/L碳纳米管的伸长生根培养基。

在本发明的具体实施例中，使用大豆品种为中黄35，该品种为王连铮等培育的高产高油早熟广适应性的大豆优良品种，2008年推广面积为1118万亩，为目前国内推广面积最大的大豆品种，具有重要的研究价值。因此建立高效的大豆中黄35组培体系，将为该品种优良性质的分子遗传转化研究奠定基础，具有重要的理论意义和应用价值。

本发明提供了一种使用纳米材料促进大豆子叶节外植体分化和再生的组织培养方法，其易于操作，效果明显，能够建立高效的组培体系，而且并不加大组培工作量，对大豆组培效率的提高具有重要意义。

附图说明

图1显示大豆中黄35在种子萌发培养基上及子叶节外植体在诱导分化培养基上，A为中黄35大豆在种子萌发培养基上；B为切割中黄35大豆种子制备的子叶节外植体在诱导培养基上。

图2显示碳纳米管处理对大豆中黄35子叶节外植体分化频率的影响，其中A为外植体在SINM0培养基上，B为外植体在SINM4培养基上，C为外植体在SINM40培养基上，D为外植体在SINM400培养基上。