[发明专利]一种带谷胱甘肽配体的亲和层析多孔介质的制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种带带谷胱甘肽(以下简称谷胱甘肽)配体的亲和层析多孔介质的制备方法和应用，属于生物医用高分子材料领域。 

技术背景

谷胱甘肽-s-转移酶(GST)是一种分子量约26000的蛋白质，因其水中溶解性能良好，在大肠杆菌中高水平表达且保持与谷胱甘肽特异性结合的酶活性等特点，被广泛应用于基因工程融合蛋白体系的标签蛋白。通过在亲和介质上固定谷胱甘肽分离破碎菌液中带有GST标签的蛋白，采用游离谷胱甘肽将其洗脱，而后切除GST标签可以获得目标蛋白。 

目前用于GST标签蛋白分离的亲和介质技术为少数公司垄断，通常采用琼脂糖凝胶微球作为基体，在其表面引入活性基团，再键合配体谷胱甘肽得到亲和层析介质。此种亲和层析介质制备过程复杂，价格昂贵。中国专利(CN1715403A)曾经尝试在商品化琼脂糖微球表面通过1，4-丁二醇二缩水甘油醚或环氧氯丙烷为交联剂，优化反应条件键合谷胱甘肽，希望得到与国外商品化产品性能相近的亲和层析介质。结果虽然这种材料价格有所降低，也有一定的分离作用，但是它制备过程仍然繁琐，需要多步反应并纯化才可键连上配体。另外凝胶微球形式的填料对填柱的技术要求都很高，如果在填柱过程中填料颗粒堆积不均匀或者有气泡产生就会影响分离效果，以上原因限制了此种分离材料的应用。 

也有文献[1]采用磁性微球技术，表面通过二硫键键合配体谷胱甘肽，用于GST标签蛋白分离。此种介质不需要使用分离柱，但超顺磁微球的制备和表面修饰本身有相当大的技术难度和相当高的制造成本，如做成产品售价将远高于琼脂糖凝胶微球，且分离时必须使用外加磁场，进一步增加了分离成本。磁性微球产品通常在毫克级，分离能力也受到限制，仅适用于微量多品种蛋白的分离纯化。 

所以，目前亲和层析介质已经成为限制基因工程产业化的巨大瓶颈，迫切需要制备方法简单、廉价、操作简单而高效的GST蛋白亲和层析介质。 

发明内容

为了解决已有技术存在的问题，本发明提出一种带谷胱甘肽的亲和层析多孔介质的制备方法和应用。 

本发明采用乳液模板法，以双键修饰的葡聚糖溶液为外部水相，以自由基引发剂的甲苯溶液为内部油相，以溶解在外水相中的谷胱甘肽(谷胱甘肽)为链转移剂，通过自由基聚合，一锅法合成带谷胱甘肽配体的亲和层析多孔介质。 

本发明提供的一种带谷胱甘肽配体的亲和层析多孔介质的制备方法，步骤如下： 

(1)配制谷胱甘肽的水溶液：称取谷胱甘肽，溶解在蒸馏水中，谷胱甘肽浓度为1％～2.5％(w/v)，加入谷胱甘肽摩尔量1.2-2倍的二硫苏糖醇(DTT)，机械搅拌反应1-2h； 

(2)配制双键修饰葡聚糖的乳液：称取双键修饰葡聚糖加入上述(1)制备的谷胱甘肽的水溶液中，谷胱甘肽的水溶液体积与双键修饰葡聚糖质量的比例为100mL∶20-30g，加入乳化剂，乳化剂质量与水相溶液体积比例为10-15g∶100mL，机械搅拌20min；使用的乳化剂是Triton X-405、吐温80、吐温40或Pluronic F-68； 

(3)配制偶氮二异丁腈(AIBN)的甲苯溶液，浓度为1-2％(w/v)； 

(4)油水乳液配制：搅拌下向双键修饰葡聚糖的乳液中滴加AIBN甲苯溶液，AIBN甲苯溶液总体积是双键修饰葡聚糖溶液体积的3至5倍，滴加完成后继续搅拌5min； 

(5)聚合固化：将上述反应混合物倒入模具内腔中，置于60-80℃烘箱中固化12-36h成型；所述的模具内腔的形状为圆柱体； 

(6)洗涤纯制：从模具中取出块状材料，先在25℃摇床中用二甲基亚砜(DMSO)振荡抽提甲苯，后用索氏提取器对水提取，除去有机溶剂及其他杂质，冷冻干燥，获得亲和层析多孔介质； 

所述的双键修饰的葡聚糖具有下列结构： 

其中，母体葡聚糖的数均分子量为4-50万，每100个糖环上双键的个数为20-30个。它的制备方法已由文献[2-5]给出。 

本发明的另一个目的是提供上述带谷胱甘肽配体的亲和层析多孔介质的一种应用，即用其装填层析柱，用于GST或以GST为标签的融合蛋白的分离纯化。 

使用本发明所制备的带谷胱甘肽配体的亲和层析多孔介质装填层析柱的方法，是将所制备的圆柱形多孔介质直接装入层析柱，用层析柱的流动相液体预浸溶胀，使其径向充满层析柱。