[发明专利]一种检测调节性T细胞免疫抑制功能的方法

说明书

[技术领域]

本发明涉及一种细胞检测方法技术领域，具体地说是一种检测调节性T细胞免疫抑制功能的方法。

[背景技术]

调节T细胞，可以从自然调节性T细胞分化而来，也可以来自其他初始T细胞，表达CD25分子和Foxp3，其分化和发挥功能必需有特定细胞因子的参与。在维持外周免疫耐受，阻止自身免疫病的发生以及限制慢性炎症性疾病等方面起到重要的作用。如今测定调节性T细胞的免疫抑制功能常采用3H-TdR掺入法，原理为T淋巴细胞受ConA或PHA激活后，进入细胞周期有丝分裂。当进入细胞周期S期时，细胞合成DNA量明显增加，在培养基中加入氚(3H)标记的DNA前身物质胸腺嘧啶核苷(TdR)，则3H-TdR被作为合成DNA的原料被摄入细胞，掺入到新合成的DNA中。根据同位素掺入细胞的量可推测淋巴细胞对刺激物的应答水平。掺入的同位素3H经液体闪烁测量法测出，将3H每分脉冲数(cpm)加以计算，用不同公式表示结果。

该方法不但需要专门的昂贵设备如液体闪烁仪、细胞收集仪和专门的试剂如β液体闪烁液等，更重要的是同位素3H可以造成对周围环境的放射性污染。

[发明内容]

本发明的目的就是要解决上述的不足，而提供一种检测调节性T细胞免疫抑制功能的方法。

为实现上述目的设计了一种检测调节性T细胞免疫抑制功能的方法，其中该方法步骤包括：

1)纯化CD4⁺T细胞并用PBS磷酸盐缓冲液洗涤；

2)10⁷CD4⁺T细胞重悬于500μl预热的PBS磷酸盐缓冲液中；

3)加入等体积CFSE羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂，预热PBS磷酸盐缓冲液5μM，CFSE羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂终浓度为2.5μM；

4)室温孵育2分钟；

5)加入等体积的胎牛血清，室温孵育1分钟；

6)完全培养基洗涤3次，重新计数，加入96孔板培养5天；

7)加入调节性T细胞，第5天时根据CFSE羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂的强弱检测其对反应细胞的抑制能力。

所述室温孵育为避光条件。

本发明的有益效果：

1.安全：不需使用放射性同位素，不存在安全隐患；

2.时间长：标记的荧光可以维持长达数周之久；

3.活体标记：可以追踪细胞在体内的分裂增殖过程；

4.相关性高：与H3掺入法结果一致，可代替后者；

5.特定跟踪：可以与细胞亚群特定抗体结合使用；

6.简单：操作简单，可靠；

7.稳定：进入细胞后荧光不受内环境影响；

8.结果客观：对细胞生理活动没有任何影响；

9.经济实惠：费用经济，效率高。

[附图说明]

图1是本发明的方法步骤图；

图2是本发明的细胞分裂增殖图；

图3是本发明CFSE强度检测示意图；

[具体实施方式]

下面结合附图对本发明作以下进一步说明：

本发明的方法步骤包括：

8)纯化CD4⁺T细胞并用PBS磷酸盐缓冲液洗涤；

9)10⁷CD4⁺T细胞重悬于500μl预热的PBS磷酸盐缓冲液中；

10)加入等体积CFSE羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂，预热PBS磷酸盐缓冲液5μM，CFSE羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂终浓度为2.5μM；

11)室温孵育2分钟，避光条件；

12)加入等体积的胎牛血清，室温孵育1分钟，避光条件；

13)完全培养基洗涤3次，重新计数，加入96孔板培养5天；

14)加入调节性T细胞，第5天时根据CFSE羟基荧光素二醋酸盐琥珀

酰亚胺脂的强弱检测其对反应细胞的抑制能力。