[发明专利]一种P2Y1稳定表达细胞系的建立及其在药物筛选中的应用

说明书

技术领域

本发明属于生物工程领域和医药技术领域，具体涉及一种P2Y1稳定表达细胞系及其在药物筛选中的应用。

背景技术

人类血小板包括三种不同的ADP受体：P2Y1、P2Y12和P2X1。P2X1是配体门控离子通道，P2Y1、P2Y12是与不同的两种G蛋白偶联受体(GPCR)。P2Y1属于G蛋白偶联受体中的Gi类，其中P2Y1、P2Y12是ADP作用的受体，也是ADP受体阻滞剂作用靶点。

ADP与P2Y1受体结合后，P2Y1受体与Gq蛋白藕连激活磷酯酶C从而导致Ca2+从细胞外流入细胞内，细胞内Ca²⁺浓度的升高激活了蛋白激酶C引起血小板变形和聚集。P2Y1受体是第一个被克隆出来的P2受体，在P2Y1受体缺失的小鼠中，ADP不能引起血小板的聚集。用选择性的P2Y1受体拮抗剂A2P5P或A3P5P对ADP受体的研究中发现P2Y1受体的激活导致迅速和短暂的血小板聚集，说明P2Y1受体在血小板聚集的早期发挥重要的作用。但这些拮抗剂对ADP诱导的腺苷酸环化酶抑制并没有效果，有研究表明P2Y1受体不能充分地诱导所有与ADP有关的血小板聚集.说明一定有另外一种受体介导ADP对血小板的这种功能。

发明内容

本发明的目的是提供一种P2Y1稳定表达细胞系的制备方法。

本发明提供的P2Y1稳定表达细胞系的制备方法，包括以下步骤：

1)将P2Y1基因的编码序列插入到真核表达载体的多克隆位点，得到重组表达载体；

2)将步骤1得到的重组表达载体导入宿主细胞中，筛选得到稳定表达P2Y1的细胞系。

上述真核表达载体具体可为pTagLite-Snap、pEGFP-N3等。

为了便于对表达的P2Y1进行细胞定位，可在真核表达载体上加入能于宿主中表达并产生颜色变化的酶或发光化合物的基因，如SNAP、GFP、YFP等。

上述宿主细胞可为Hela细胞、MDA-MB-231细胞、MCF-7细胞等。

利用上述方法制备的P2Y1稳定表达细胞系也属于本发明的保护范围。

本发明的另一个目的是提供一种筛选预防和/或治疗缺血性脑卒中、心肌梗死等药物的细胞模型。

实验证明，本发明的P2Y1稳定表达细胞株对P2Y1阻断剂和P2Y1抗体敏感，作用显著。本发明的P2Y1稳定表达细胞系为深入探索P2Y1在高血压中的作用提供实验技术平台，可用于筛选预防和/或治疗缺血性脑卒中、心肌梗死等药物。

附图说明

图1为重组表达载体pTagLite-Snap-P2Y1的构建流程图

图2为各稳定表达P2Y1细胞系的P2Y1表达量实验结果

图3为P2Y1稳定表达细胞系对P2Y1抑制剂的敏感性分析实验结果

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，实施例仅为解释性的，绝不意味着以任何方式限制本发明的范围。

本发明的P2Y1稳定表达细胞系的具体构建流程如图1所示。

实施例1.

重组真核表达载体pTagLite-Snap-P2Y1的构建

下述实验过程中所用的DNA引物由上海生工生物技术有限公司合成。

根据P2Y1蛋白编码框的cDNA序列，设计PCR引物如下：正向引物：

5’-ACTGATATCATGACCGAGGTGCTGTGGCCGGCTG-3’(下划线处为限制性内切酶的识别位点)；反向引物：

5′-AACGAGCTCCAGGCTTGTATCTCCATTCTGCTTG-3′(下划线处为限制性内切酶的识别位点)。

取人脐静脉内皮细胞HUVEC并提取总RNA，将其反转成cDNA，以该cDNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增。将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳纯化和回收，用限制性内切酶EcoRV和Xho I对纯化回收后的产物进行酶切，酶切产物再次进行琼脂糖凝胶电泳纯化和回收，得到P2Y1蛋白编码框的cDNA序列。同时，将真核表达载体pTagLite-Snap(购自Cisbio公司)也用EcoRV和Xho