[发明专利]级联侵入信号放大反应结合纳米金-寡核苷酸探针可视化核酸检测方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及核酸侵入信号放大方法与纳米金-寡核苷酸探针。具体涉及一种级联侵入信号放大反应结合纳米金-寡核苷酸探针可视化核酸检测方法。

背景技术

核酸检测已经广泛应用于临床诊断、环境监测以及传染性疾病的预防与控制等很多方面。目前常用的核酸检测技术大多基于模板扩增原理，即扩增产物与靶核酸序列相同，如聚合酶链式反应技术(Polymerase Chain Reaction，PCR)、环介导的核酸等温扩增技术(Loop-MediatedIsothermal Amplification，LAMP)、滚环扩增技术(Rolling Cycle Amplification，RCA)、基于核酸序列扩增技术(Nucleic Acid Sequence Based Amplification，NASBA)、转录酶介导的扩增技术(Transcription Mediated Amplification，TMA)、解链酶扩增技术(Helicase DependantAmplification，HDA)、链置换扩增技术(Strand Displacement Amplification，SDA)等。上述核酸扩增方法由于扩增产物与靶核酸序列相同，因此极易造成产物交叉污染，使核酸检测经常出现假阳性的结果。

为了避免扩增产物的交叉污染，近年来发展了一些不扩增靶核酸，而是由靶核酸引发其他信号分子扩增，间接地对靶核酸进行检测的核酸信号扩增检测方法，如分枝DNA法(Branch-DNA，B-DNA)、核酸侵入信号扩增实验(Invader Assay)以及一些基于电化学检测的信号扩增法。其中，B-DNA法及核酸侵入信号扩增实验均有较高的灵敏度，但它们都需要合成特殊结构或特殊荧光标记的探针，提高了检测成本；而基于电化学检测的信号扩增法往往灵敏度较低，达不到核酸检测的要求。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种基于信号放大和纳米金-寡核苷酸探针的可视化核酸检测方法，即提供一种级联侵入信号放大反应结合纳米金-寡核苷酸探针可视化核酸检测方法。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

本发明利用纳米金-寡核苷酸探针，可视化检测级联侵入信号放大反应结果，建立了一种高灵敏度的可视化的核酸检测方法。

本方法依次包括以下步骤(反应原理如图2所示)：

(1)级联侵入信号放大反应的第一步核酸侵入信号扩增阶段：设计针对靶核酸特异性的一对探针，要求与靶核酸杂交后，上游探针3’端必须侵入下游探针1个碱基，下游探针有一段翘起片段，称为5’flap，并且其中下游探针与靶核酸互补区域的解链温度在核酸5’外切酶或5’flap内切酶的酶切反应温度±1℃范围内，而上游探针与靶核酸互补区域的解链温度要高于核酸5’外切酶或5’flap内切酶的酶切反应温度5～10℃；所述的靶核酸与所述的上、下游探针在核酸侵入反应体系中杂交形成探针-靶核酸特异性结构，其中下游探针浓度大于上游探针浓度；向反应体系中加入核酸5’外切酶或5’flap内切酶，核酸5’外切酶或5’flap内切酶识别所述的探针-靶核酸特异性结构，并将下游探针的5’flap连同与模板配对的第一个碱基切下，因为所述的酶切反应温度接近下游探针与模板配对部分的熔解温度，下游探针被切割后会很快与靶核酸分离，没有被切割的完整的下游探针会再次与靶核酸杂交，而上游探针熔解温度高于反应温度，可以牢固地结合在靶核酸上，与新杂交的完整的下游探针再次形成所述的探针-靶核酸特异性结构，进而继续被核酸5’外切酶或5’flap内切酶切割，形成flap片段的积累；

(2)级联侵入信号放大反应的flap片段循环信号扩增阶段：反应体系中的发卡探针可捕获步骤(1)积累的flap片段，并杂交形成一个flap片段-发夹探针特异性结构，该结构也可被反应体系中的核酸5’外切酶或5’flap内切酶识别，并将发夹探针的5’flap连同与模板配对的第一个碱基切下，被切割的发夹探针与步骤(1)产生的flap片段分离，没有被切割的完整的发夹探针会再次与步骤(1)产生的flap片段杂交，再次形成所述的flap片段-发夹探针特异性结构，进而继续被核酸5’外切酶或5’flap内切酶切割，从而大量的发夹探针被切割；