[发明专利]一种烟草烟碱转化株苗期的分子生物学鉴定方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种烟草烟碱转化株的鉴定方法，特别是涉及一种烟草烟碱转化株苗期的分子生物学鉴定方法。

背景技术

目前研究结果表明，烟草中的生物碱主要有四种：烟碱、降烟碱、新烟草碱和假木贼碱四种。普通烟草属烟碱积累型，以烟碱为主，其含量占总生物碱的90％以上，降烟碱是第二大生物碱，含量一般只占总生物碱的3-5％，另外两种生物碱仅占很少部分。烟碱含量的高低是决定烟叶感官品质的重要因素，一般要求烟碱含量适宜，以达到生理强度适中、吃味醇和、刺激性小的目的。降烟碱亦称去甲基烟碱，主要由烟碱在去甲基酶的作用下脱甲基形成。由于降烟碱易于在烟叶调制和陈化过程中发生一系列亚硝化和酰化等生化反应，形成具有致癌作用的烟草特有亚硝胺(TSNAs)的主要成分N-亚硝基降烟碱(NNN)及麦斯明、甲酰降烟碱、乙酰降烟碱等酰化产物，导致烟叶有害成分增加和香味品质下降，直接影响着吸烟者的身体健康。因此，烟叶减害、降低烟草特有的亚硝胺含量成为目前国际烟草界的共识和主攻方向，一直是研究的重点和热点。

我国对烟碱转化的研究起于世纪90年代末期，研究结果表明，中国白肋烟、马里兰烟和香料烟均不同程度的存在烟碱转化株比例、降烟碱含量和烟碱转化率过高的问题。目前，美国已将降烟碱含量作为考核新品种的主要指标，制定了降烟碱(区域试验和小区试验)不超过被测样品总生物碱13％的最高限额，超限品种不得种植(王晓云，邓云龙，李红莺.国外烤烟育种概况.云南农业科技，1999，4：16-19)。

群体中的转化株必须在烟叶生长的早期甚至苗期阶段被鉴定和清除，以保证品种群体材料非转化株的高度纯合性，由于在外观形态上无法区分非转化株和转化株，因此，需要通过化学或者生物技术手段来加以鉴定区分。中国烟草总公司郑州烟草研究院申请的专利号“ZL2007100540828”，公开号：“CN 101070535A”的发明专利一种诱导烟草烟碱提前转化方法及其应用，是在团棵期取8-12叶位(自下而上)的烟叶1片，喷施诱导烟碱转化性状在绿叶中早期表达的药品3，5-二硝基水杨酸，浓度为0.1％，然后进行调制处理后测定烟碱和降烟碱含量，以此判断烟株的烟碱转化高低属性，再进行田间转化株剔除。本方法虽然有效，但存在以下不足：1、取样时期在移栽后的团棵期，仍然偏迟，剔除转化株后浪费了田地，且难以保证目标群体大小；2、需化学药品诱导方可；3、鉴定结果受环境因素影响：比如药品浓度、调制温度和时间、化学检测的影响因子等。因此，虽有较好的借鉴作用，但仍不够高效与及时，无法满足现实的需求。

发明内容

本发明的为解决现有技术的不足提供一种苗期鉴定和纯化非转化品种群体的方法，具体是一种烟草烟碱转化株苗期的分子生物学鉴定方法，将鉴定时期从团棵期提前至苗期，而且鉴定手段简单、准确性高，试验效果只决定于其内在的遗传物质而不受外部环境条件的影响，这为提高烟叶安全性和改善烟叶品质，为低危害烟叶开发奠定了坚实的理论与技术基础。

所述一种烟草烟碱转化株苗期的分子生物学鉴定方法，其特征在于具体步骤依次如下：

A、对需鉴定的烟苗逐个挂牌以标识，然后于苗期对每个被标识的烟苗进行鲜叶取样，每个烟苗取样量为1-2个叶片，取好的鲜叶样品用密封袋装好，并做好与原烟苗一致的标识，迅速放入冰盒或超低温冰箱中保存；

B、提取基因组DNA：取出每个密封袋中的鲜叶样品，采用CTAB法提取各样品烟苗基因组DNA，纯化后保存备用；

C、对基因组DNA进行PCR反应：用紫外分光光度计测定B步骤中提取的烟苗基因组DNA的浓度，然后取各样品烟苗基因组DNA溶液少许，将其浓度稀释成50ng/μL作为反应模板进行PCR反应，PCR反应中的特异引物序列：

正向引物：5’-ATGGTTTTTCCCATAGAAGCC-3’，

反向引物：5’-TCGAGGTCGACGGTATC-3’；

D、PCR产物的琼脂糖凝胶电泳及电泳结果的读取：将步骤C中所获得的PCR产物与溴酚蓝-甘油溶液以4∶1的体积比混合，注入样品槽，同时注入对照ladder进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后取出凝胶，清除表面的溴化乙锭溶液，然后将胶板放入凝胶成像仪的观察板上，利用电脑成像系统在波长254nm紫外灯下进行观察，拍照记录下电泳图谱，并保存以进行比较分析；