[发明专利]大青杨转基因体系建立及其转基因植株的扩繁方法

说明书

技术领域

本发明涉及转基因体系建立及其转基因植株的扩繁方法。

背景技术

大青杨(Populus ussuriensis kom.)又名又称憨大杨、哈达杨，主要分布于黑龙江、吉林省，俄罗斯(远东地区)，朝鲜。是中国东北林区特有的乡土树种，木材轻软，材质洁白、致密、耐朽力强，是造纸及胶合板材极好的原料。

大青杨的造林地多为土壤干旱瘠薄、地力衰退严重的退耕还林地，致使大青杨造林成活率低，林木生长周期长，采用常规育种技术进行新品种选育所需时间长、见效慢。在以往的大青杨研究主要集中在种源试验、种子播种、航天育种、多倍体育种等常规育种，随着现代生物技术的飞速发展，利用农杆菌介导法转基因大青杨尚未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供大青杨转基因体系建立及其转基因植株的扩繁方法。

大青杨转基因体系建立的方法按以下步骤实现：一、将一年生大青杨叶片和茎段在超净工作台内用体积浓度为70％的酒精浸泡30s～1min，灭菌水冲洗2～3遍，然后转入质量浓度为1％的NaClO溶液中消毒10～20min，灭菌水冲洗3～5遍，再接种到含0.5mg/L6-苄氨基嘌呤、0.1mg/L萘乙酸、20g/L蔗糖和5g/L琼脂的1/2MS培养基上培养一个月，获得组培苗；

二、挑取一个含有LbDREB基因的工程菌的单菌落接种到20ml的LB培养基上培养至菌液的OD₆₀₀值为0.5～1.0，然后用移液枪吸3～5ml的菌液至离心管中，以12000r/min的转速离心1min，弃上清后加入等体积的1/2MS培养基并混匀，获得侵染液，然后倒入培养皿中，再取组培苗的形态学上端的第二、第三叶片和形态学上端的三个茎节置于培养皿中，将叶片边缘切去后切成0.5×0.5cm的块，并在叶脉处横切2～3刀，茎节切去两边，侵染30min后取出叶片和茎节接种到含0.5mg/L 6-苄氨基嘌呤、0.1mg/L萘乙酸、20g/L蔗糖和5g/L琼脂的1/2MS培养基上暗培养2天，然后用灭菌水冲洗3～5遍，再放入含200mg/L头孢霉素的1/2MS培养基中，置于128r/min摇床上摇20～30min，取出后用灭过菌的滤纸吸干，即完成叶片和茎节的脱菌；

三、脱菌后叶片和茎节接种到含50mg/L卡那霉素、200mg/L头孢霉素、0.5mg/L 6-苄氨基嘌呤、0.1mg/L萘乙酸、20g/L蔗糖和5g/L琼脂的1/2MS培养基中暗培养至愈伤组织或不定芽形成，然后移至光下并在温度为25℃、湿度为70％、光照强度为40μmol·m^-2·s^-1、每天光照16h的条件下培养1～2个月，获得抗性芽；

四、将抗性芽接种到含0.1mg/L 6-苄氨基嘌呤、0.1mg/L萘乙酸、20g/L蔗糖和5g/L琼脂的1/2MS培养基中培养至抗性芽高于3cm，然后转接于含20g/L蔗糖和5g/L琼脂的1/2MS培养基中进行生根培养，再挑选根系发达的植株移栽到栽培基质中，浇透水并覆盖塑料膜，在温度为25℃、湿度为70％、光照强度为40～100μmol·m^-2·s^-1、每天光照16h的条件下培养6天后去掉覆盖的塑料膜，获得再生植株；

五、取再生植株的叶片，用CTAB法提取基因组DNA，以含LbDREB基因的质粒DNA做阳性对照，未转化植株DNA及ddH₂O做阴性对照，进行PCR扩增，选取阳性的大青杨转基因再生植株，再用改良SDS法提取阳性的大青杨转基因再生植株的RNA，进行RT-PCR检测，选取阳性的大青杨转基因再生植株，即完成大青杨转基因体系建立。

大青杨转基因植株的扩繁方法按以下步骤实现：一、大青杨转基因体系建立所获得的大青杨转基因再生植株，取其根、茎段和叶片接种到含0.5mg/L 6-苄氨基嘌呤、0.1mg/L萘乙酸、20g/L蔗糖和5g/L琼脂的1/2MS培养基上培养一个月，获得组培苗；

二、分别取组培苗的根、茎段和叶片，用CTAB法提取基因组DNA，以含LbDREB基因的质粒DNA做阳性对照，未转化植株DNA及ddH₂O做阴性对照，进行PCR扩增，选取阳性的根、茎段和叶片；

三、重复操作步骤一和步骤二2次，即完成大青杨转基因植株的扩繁。