[发明专利]雄性罗非鱼精巢细胞vasa基因表达的调控方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因调控方法，具体而言涉及调控雄性罗非鱼精巢细胞vasa基因表达的方法。

背景技术

vasa是动物细胞中特异性表达基因，其编码的蛋白为DEAD(Asp-Glu-Ala-Asp)家族中的一种解旋酶，首先于果蝇中发现。随后在水螅、涡虫、线虫、尼罗罗非鱼、虹鳟、黄鳝、鲤鱼、斑马鱼、爪蟾、鸡[11]、小鼠和人等物种中克隆获得了同源基因。系统进化分析表明从低等无脊椎动物到高等哺乳动物中vasa均保持高度保守。基因表达分析表明在绝大多数物种中，vasa仅表达于生殖细胞中。已经证明，vasa基因敲除小鼠生殖细胞不能完成减数分裂，精子发生受阻。在雌性果蝇中vasa突变体中卵子有缺陷，即使受精，个体发育后则会缺少生殖细胞。对斑马鱼和果蝇的研究表明，vasa在卵细胞中为母源性基因，在早期胚胎发育中起重要作用。另外，vasa可以和诸如Oskar、Tudor以及Staufen等蛋白一起参与生殖质的形成。有研究表明vasa的表达可引起其它基因的表达下降。进一步的研究表明，vasa和翻译因子eIF5B可对翻译过程起调控作用。目前，vasa已经被认为是生殖细胞的特异性标记分子，针对vasa开发的抗体以及GFP载体等分子标记已经运用于多项研究中。

vasa最早在果蝇中发现，在脊椎动物中作为生殖细胞高度特异表达基因，是生殖细胞中公认的分子标志。后来的实验证明，在不同动物中vasa均为DEAD(Asp-Glu-Ala-Asp)家族中的一种解旋酶。

迄今为止，鱼类中vasa基因已经被广泛克隆，而且在不同物种中有不同结构。在南方鲶中已经发现有两种vasa基因，且有很高的同源性。在尼罗罗非鱼中，也发现了两种vasa基因片段，这可能是鱼类在多倍化的过程中演化而来。本发明克隆得到的vasa与尼罗罗非鱼两种vasa相似性最高，达到96.3％和96.1％，而与其它物种vasa基因的同源性则较低。进化树分析结果与奥利亚罗非鱼的分类学地位相一致。然而在奥利亚罗非鱼中是否也存在着其它形式的vasa基因还有待研究。

vasa在脊椎动物中仅仅于生殖细胞中表达，在奥利亚罗非鱼中也得到印证。在vasa基因敲除小鼠中，精子发生阻滞于第一次减数分裂的偶线期，从而导致精细胞凋亡，最终引起雄性小鼠不育。在鱼类中vasa主要于精原细胞和还未进入减数第一次分裂的精母细胞中，但在未成熟的精子中表达下降，而在成熟精子中则不表达。本文结合原代细胞培养技术，在培养过程中加入不同浓度的LHRH-A后分析原代精巢细胞中vasa mRNA的表达差异。结果显示在LHRH-A刺激后vasa mRNA的表达水平明显降低。在性腺发育调控中，下丘脑-垂体-性腺轴在激素水平扮演者重要角色。在适应的环境刺激下，如温度、光照等，下丘脑分泌GnRH刺激垂体，垂体LH随之表达升高，LH进入血液循环，最终在鱼类性腺成熟以及排卵排精过程中起重要作用。

奥利亚罗非鱼(Oreochromis aurea)属于鲈形目(Perciformes)，鲡鱼科(Cichlidae)，罗非鱼属(Oreochromis)。奥利亚罗非鱼对温度和盐度的耐受能力比尼罗罗非鱼强，因此在越冬保种时较尼罗罗非鱼有优势。在实际生产中，雄性奥利亚罗非鱼主要作为奥尼罗非鱼的杂交亲本在繁殖育种中广泛使用。生产得到的奥尼杂交罗非鱼雄性率很高(可达95％以上)，不但具有母本尼罗罗非鱼生长速度快的优势，而且还具有父本奥里亚罗非鱼抗逆性强的优势，是我国罗非鱼养殖业养殖的主要品种之一。随着我国大规模罗非鱼尤其是杂交罗非鱼养殖业的发展，必须对其亲本的生殖生理调控进行深入研究，以便指导育种工作。vasa是生殖细胞发育分化的重要基因，对其进行研究不仅能了解其在奥利亚罗非鱼中的作用，而且对今后在奥利亚罗非鱼生殖细胞的定位研究开发分子标记有意义。

发明内容

为了对雄性罗非鱼精巢细胞vasa基因表达进行调控，本发明采用如下的技术方案：

一种雄性罗非鱼精巢细胞vasa基因表达进行调控的方法，其特征在于使用LHRH-A进行调控。

在本发明的一个优选实施方式中，其特征在于对奥利亚罗非鱼精巢进行原代培养，培养时使用LHRH-A处理。

在本发明的一个优选实施方式中，其特征在于LHRH-A的浓度为10^-9M以上，优选为10^-8M及其以上。

在本发明的一个优选实施方式中，特征在于所述的罗非鱼为奥利亚罗非鱼。

本发明另外一方面还涉及一种罗非鱼人工繁殖时进行催产的方法，其特征在于给予一定量的LHRH-A。